Article Annexe AUTONOME VIGUEUR, en vigueur depuis le (Arrêté du 19 novembre 1987 RELATIF AUX METHODES OFFICIELLES D'ANALYSES DES LAITS FERMENTES ET DES YAOURTS)
Article Annexe AUTONOME VIGUEUR, en vigueur depuis le (Arrêté du 19 novembre 1987 RELATIF AUX METHODES OFFICIELLES D'ANALYSES DES LAITS FERMENTES ET DES YAOURTS)
1. Objet et domaine d'application.
Cette méthode a pour objet de décrire une technique enzymatique permettant de déterminer spécifiquement la teneur en lactose des laits fermentés et des yaourts en présence d'autres glucides et de substances réductrices.
Cette méthode est applicable à tous les produits lactés sucrés.
2. Définition.
La teneur en lactose est le résultat obtenu par l'application de la méthode décrite ci-après. Elle est exprimée en pourcentage en masse.
3. Principe.
3.1. Défécation.
Précipitation de la matière grasse et des protéines par addition d'hexacyanoferrate de potassium et de sulfate de zinc. L'excès d'ions Zn++ présent est précipité en milieu alcalin puis éliminé par filtration.
3.2. Dosage enzymatique.
Le lactose est hydrolysé en glucose et b-galactose en présence de bêta-galactosidase.
Le b-galactose est oxydé par la nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD) en acide galactonique en présence de b-galactose déshydrogénase (Gal-DH) :
bêta-galactose + NAD + / Gal - DH ac. galactonique + NADH + H +
La quantité de NADH formée au cours de la réaction est proportionnelle à la quantité de lactose. Elle est mesurée au spectrophotomètre à 340 nm contre l'air.
4. Réactifs.
Tous les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée pour la préparation des solutions d'enzymes et des échantillons doit être d'une pureté au moins égale à celle de l'eau bidistillée sur verre.
4.1. Solution d'hexacyanoferrate (II) de potassium.
Dissoudre 15 g d'hexacyanoferrate (II) de potassium dans l'eau et compléter à 100 ml.
4.2. Solution de sulfate de zinc.
Dissoudre 30 g de sulfate de zinc (ZnSO4, 7H2O) dans l'eau et compléter à 100 ml.
4.3. Solution d'hydroxyde de sodium 0,1 M.
Dissoudre 4,00 g d'hydroxyde de sodium (NaOH) dans l'eau et compléter à 1 000 ml.
4.4. Tampon citrate pH 6,6.
Dissoudre 2,8 g de citrate trisodique dihydraté (C6H5 Na3O7, 2H20), 0,625 g de sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4, 7H2O) dans environ 40 ml d'eau. Ajuster à pH 6,6 avec une solution d'acide sulfurique environ 2 M ou une solution d'hydroxyde de sodium environ 1 M. Compléter à 50 ml avec de l'eau.
Conservation quatre semaines à + 4 °C.
4.5. Suspension de b-galactosidase (d'E. coli) dans une solution de sulfate d'ammonium 2,2 M, pH environ 6.
L'activité spécifique de la suspension de b-galactosidase (EC 3.2.1.23) doit être d'au moins 150 U/ml à 25 °C avec le lactose comme substrat.
Conservation douze mois à + 4 °C.
4.6. Tampon phosphate pH 8,6.
Dissoudre 8,3 g d'hydrogénophosphate de potassium (K2HPO4) dans environ 40 ml d'eau. Ajuster à pH 8,6 avec une solution d'acide sulfurique (H2SO4) environ 2 M ou une solution d'hydroxyde de sodium (NaOH) environ 1 M.
Compléter à 50 ml avec de l'eau.
Conservation quatre semaines à + 4 °C.
4.7. Suspension de galactose-déshydrogénase (de Ps. fluorescens) dans une solution de sulfate d'ammonium 2,2 M, pH environ 6.
L'activité spécifique de la suspension de galactose-déshydrogénase (EC 1.1.1.48) doit être d'au moins 25 U/ml à 25 °C avec le galactose comme substrat.
4.8. Solution de nicotinamide-adénine-dinucléotide (NAD).
Dissoudre 100 mg de NAD dans 10 ml d'eau.
Conservation quatre semaines à + 4 °C.
4.9. Solution de lactose hydraté.
Dissoudre dans l'eau 4,5 g de lactose (C12H22O11, H2O) préalablement séché à masse constante à 87 °C, et compléter à 100 ml.