Article annexe AUTONOME VIGUEUR, en vigueur depuis le (Arrêté du 12 novembre 1986 relatif aux méthodes officielles de dosage des vitamines A, D et E dans les aliments pour animaux familiers)
Article annexe AUTONOME VIGUEUR, en vigueur depuis le (Arrêté du 12 novembre 1986 relatif aux méthodes officielles de dosage des vitamines A, D et E dans les aliments pour animaux familiers)
1. Objet et domaine d'application.
La présente méthode a pour objet de doser l'alpha tocophérol (vitamine E) dans les aliments secs ou humides pour animaux familiers.
2. Principe.
Hydrolyse à chaud de l'échantillon par une solution d'hydroxyde de potassium en milieu éthanolique. Extraction par l'éther de pétrole et purification par l'acide sulfurique à 85 p. 100. Dosage de la vitamine E par chromatographie liquide haute performance (C.L.H.P.) sur colonne de gel de silice et détection U.V.. Les isomères b, d et g n'interfèrent pas sur le dosage.
3. Réactifs.
Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.
3.1. Ethanol à 95 p. 100 vol.
3.2. Solution à 20 p. 100 (m/v) de pyrogallol dans l'éthanol (3.1).
3.3. Solution à 50 p. 100 (m/v) d'hydroxyde de potassium.
3.4. Ether de pétrole (ébullition 40 - 65 °C).
3.5. Solution d'acide sulfurique à 85 p. 100 (v/v).
3.6. Solutions étalon : solution mère à 1 000 mg/ml dedlatocophérol dans l'isooctane. Solution de travail à 50 p. 100 mg/ml dans l'isooctane.
3.7. Phase mobile : mélange 99/l (v/v) d'isooctane et d'alcool isopropylique.
4. Appareillage.
Matériel courant de laboratoire, notamment :
4.1. Rampe de chauffage (chauffe-ballon ou bain d'eau) avec réfrigérants à rodage.
4.2. Ballons d'un litre à rodage adaptable aux réfrigérants.
4.3. Ampoules à décanter de 500 ml.
4.4. Appareil rotatif à évaporation sous vide.
4.5. Ampoules à décanter de 125 ml.
4.6. Appareil de C.L.H.P. avec détection par absorption U.V..
4.7. Colonne de gel de silice de 10 mm (longueur 30 cm et 4 mm de diamètre intérieur) ou système équivalent donnant un facteur de capacité (k') de l'ordre de 0,7.
5. Mode opératoire.
5.1. Préparation de l'échantillon pour essai.
5.1.1. Cas des produits secs :
Tout ou partie de l'échantillon est broyé de façon à pouvoir passer à travers les mailles d'un tamis de 1 mm d'ouverture. Homogénéiser.
5.1.2. Cas des aliments humides :
Tout ou partie de l'échantillon est haché finement. Homogénéiser.
Note - Les échantillons doivent être traités juste avant l'analyse. L'analyse ne doit pas être effectuée en lumière directe.
5.2. Hydrolyse et extraction.
Introduire 25 g de l'échantillon préparé et pesé à 0,01 g près dans un ballon de un litre (4.2). Ajouter successivement 10 ml de solution de pyrogallol (3.2), 70 ml d'éthanol (3.1) et 20 ml de solution d'hydroxyde de potassium (3.3). Chauffer durant trente minutes à 70 - 80 °C sous réfrigérant à reflux et laisser ensuite refroidir sous courant d'eau. Ajouter 80 ml d'eau et 250 ml d'éther de pétrole (3.4) exactement mesurés. Extraire par agitation pendant quatre à cinq minutes. Laisser décanter dans le ballon. Verser la phase organique supérieure dans une ampoule à décanter de 500 ml. Laver cette phase jusqu'à neutralité et éliminer les traces d'eau à l'aide de bandes de papier filtre. Evaporer sous vide 200 ml exactement mesurés. Reprendre le résidu par 20 ml d'éther de pétrole (3.4) mesurés à la pipette. Agiter l'extrait cinq minutes sur agitateur magnétique avec 5 ml de solution d'acide sulfurique (3.5). Laisser décanter dans le ballon. Verser la phase organique supérieure dans une ampoule à décanter de 125 ml (4.5). Laver cette phase jusqu'à neutralité et éliminer les traces d'eau à l'aide de bandes de papier filtre. C'est cet extrait qui sera injecté dans le chromatographe.
5.3. Conditions de la chromatographie liquide haute performance.
Débit de la phase mobile : 1 ml/minute ;
Longueur d'onde de détection : 292 nm avec une lampe au Deutérium ou filtre à 280 nm avec lampe à vapeur de mercure ;
Sensibilité du détecteur : 0,02 ou 0,01 suivant le type de détecteur ;
Volumes injectés : 5 ml pour l'étalon et la quantité appropriée de la solution obtenue en 5.2.
6. Mode de calcul et formule.
La teneur en vitamine E exprimée en Unités Internationales par gramme d'échantillon est donnée par la formule suivante :
(formule non reproduite, voir au Journal officiel).
C et : concentration de la solution étalon ;
A et A ech : surfaces du pic de l'étalon et de l'échantillon ;
I et I ech : volumes de l'injection de la solution étalon et de l'échantillon ;
S et S ech : sensibilités du détecteur pour l'étalon et l'échantillon ;
Vi : volume d'extraction (250 ml dans la méthode) ;
Vr : volume prélevé après extraction (200 ml dans la méthode) ;
Vf : volume final après concentration (20 ml dans la méthode) ;
P : prise d'essai ;
1,097 : rapport des masses moléculaires de l'acétate de dlatocophérol au dlatocophérol.
7. Remarques.
7.1. Le dosage de la vitamine E peut être effectué à partir de l'extrait obtenu pour le dosage de la vitamine A. Cet extrait doit subir une purification par l'acide sulfurique comme indiqué dans la présente méthode.
7.2. Si la mesure des surfaces s'effectue à l'aide d'un intégrateur branché sur la sortie intégration du détecteur, ne pas tenir compte dans le calcul du rapport des sensibilités.