Article annexe AUTONOME VIGUEUR, en vigueur depuis le (Arrêté du 12 novembre 1986 relatif aux méthodes officielles de dosage des vitamines A, D et E dans les aliments pour animaux familiers)
Article annexe AUTONOME VIGUEUR, en vigueur depuis le (Arrêté du 12 novembre 1986 relatif aux méthodes officielles de dosage des vitamines A, D et E dans les aliments pour animaux familiers)
1. Objet et domaine d'application.
La présente méthode a pour objet de doser la vitamine D dans les aliments secs ou humides pour animaux familiers.
2. Principe.
Hydrolyse à chaud de l'échantillon par une solution d'hydroxyde de potassium en milieu éthanolique. Extraction par l'éther de pétrole et purification par deux chromatographies sur colonne. Dosage de la vitamine D par chromatographie liquide haute performance (C.L.H.P.) sur colonne de gel de silice et détection U.V..
La méthode ne permet pas de séparer l'ergocalciférol (vitamine D2) du cholécalciférol (vitamine D3).
3. Réactifs.
Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.
3.1. Ethanol à 95 p. 100 vol.
3.2. Solution à 20 p. 100 (m/v) de pyrogallol dans l'éthanol (3.1).
3.3. Solution à 50 p. 100 (m/v) d'hydroxyde de potassium.
3.4. Ether de pétrole (ébullition 40-65 °C).
3.5. Magnésie active (S 120 Fisher Scientific Company ou équivalent).
3.6. Hyflo supercel.
3.7. Mélange 1/1 (m/m) de (3.5) et (3.6).
3.8. Sulfate de sodium anhydre.
3.9. Alumine active neutre (Merck 1077 ou équivalent). Activer l'alumine à 100 °C à l'étuve pendant une nuit. Refroidir en dessicateur et conserver en flacon bouché.
3.10. Ether de pétrole à 5 p. 100 d'acétone (v/v). Sécher cette solution sur sulfate de sodium (3.8).
3.11. Ether de pétrole à 8 p. 100 (v/v) d'alcool absolu.
3.12. Ether de pétrole à 2 p. 100 (v/v) d'acétone. Sécher cette solution sur sulfate de sodium (3.8).
3.13. Ether de pétrole à 20 p. 100 (v/v) d'acétone. Sécher cette solution sur sulfate de sodium (3.8).
3.14. Solutions étalon : solution mère à 500 mg/ml (20 000 U.I./ml) dans l'isooctane. Solution de travail à 5 mg/ml (200 U.I./ml) dans l'isooctane.
3.15. Phase mobile : mélange 99/1 (v/v) d'isooctane et d'alcool isopropylique.
4. Appareillage.
Matériel courant de laboratoire, et notamment :
4.1. Rampe de chauffage (chauffe-ballon ou bain d'eau) avec réfrigérants à rodage.
4.2. Ballons d'un litre à rodage adaptable aux réfrigérants.
4.3. Ampoules à décanter de 500 ml.
4.4. Appareil rotatif à évaporation sous vide.
4.5. Colonnes pour chromatographie, en verre, de 25 cm de longueur et 25 mm de diamètre intérieur, munies d'un fritté de porosité 2 dans la partie inférieure.
4.6. Colonnes pour chromatographie, en verre, de 25 cm de longueur et 14 mm de diamètre intérieur.
4.7. Appareil de C.L.H.P. avec détection par absorption U.V..
4.8. Colonne de gel de silice de 10 mm (30 cm de longueur et 4 mm de diamètre intérieur) ou système équivalent donnant un facteur de capacité (k') de l'ordre de 3.5.
5. Mode opératoire.
5.1. Préparation de l'échantillon pour essai.
5.1.1. Cas des produits secs :
Tout ou partie de l'échantillon est broyé de façon à pouvoir passer à travers les mailles d'un tamis de 1 mm d'ouverture. Homogénéiser.
5.1.2. Cas des aliments humides :
Tout ou partie de l'échantillon est haché finement. Homogénéiser.
Note - Les échantillons doivent être traités juste avant l'analyse. L'analyse ne doit pas être effectuée en lumière directe.
5.2. Hydrolyse et extraction.
Introduire 60 g de l'échantillon préparé et pesé à 0,01 g près dans un ballon de un litre (4.2). Ajouter successivement 20 ml de solution de pyrogallol (3.2), 160 ml d'éthanol (3.1) et 45 ml de solution d'hydroxyde de potassium (3.3). Chauffer durant 30 minutes à 70-80 °C sous réfrigérant à reflux et laisser ensuite refroidir sous courant d'eau. Ajouter 180 ml d'eau et 250 ml d'éther de pétrole (3.4) exactement mesurés. Extraire par agitation pendant quatre à cinq minutes. Laisser décanter dans le ballon. Verser la phase organique supérieure dans une ampoule à décanter de 500 ml. Laver cette phase jusqu'à neutralité et éliminer les traces d'eau à l'aide de bandes de papier filtre. Evaporer à sec 200 ml exactement mesurés. Reprendre le résidu par 50 ml d'éther de pétrole à 5 p. 100 d'acétone (3.10).
5.3. Chromatographie sur colonne magnésie - hyflo supercel.
Verser dans la colonne (4.5) la quantité adéquate du mélange (3.7) tout en s'aidant du vide afin de bien tasser la colonne qui doit avoir 5 cm de hauteur de mélange. Mettre au sommet de la colonne du sulfate de sodium (3.8) sous une hauteur de 1 à 2 cm. Verser le contenu du ballon sur la colonne et l'éluer en s'aidant légèrement du vide.
Récupérer l'éluat dans la fiole à filtrer et continuer l'élution avec deux fois 50 ml du réactif (3.10).
Evaporer à sec l'éluat et reprendre par 5 ml environ d'éther de pétrole (3.4).
5.4. Chromatographie sur alumine.
Introduire un tampon de coton au fond de la colonne (4.6) et verser 20 ml environ d'éther de pétrole (3.4). Verser ensuite 7 g d'alumine (3.10). Protéger la tête de colonne par un peu de coton. Laisser s'écouler l'éther de pétrole. Verser ensuite 6 ml d'éther de pétrole à 8 p. 100 d'alcool absolu (3.11) puis 10 ml d'éther de pétrole (3.4). Verser l'extrait obtenu en 5.3 après la première purification. Rincer le ballon à l'aide de fractions d'éther de pétrole et les verser sur la colonne. Rincer la colonne par 40 ml d'éther de pétrole à 2 p. 100 d'acétone (3.12). Eliminer ces éluats. Eluer la colonne avec 50 ml d'éther de pétrole à 20 p. 100 d'acétone (3.13). Evaporer à sec l'éluat et reprendre le résidu par 3 ml exactement mesurés d'isooctane (3.15). C'est cet extrait deux fois purifié qui sera injecté dans le chromatographe.
5.5. Conditions de la chromatographie liquide haute performance :
Débit de la phrase mobile : 1 ml/minute ;
Longueur d'onde de détection : 264 nm avec une lampe au Deutérium ou filtre à 254 nm avec une lampe à vapeur de mercure ;
Sensibilité du détecteur : 0,005 ;
Volumes injectés : 5 ml pour l'étalon ; 25 ml pour l'échantillon.
6. Mode de calcul et formule.
La teneur en vitamine D, exprimée en Unités Internationales par gramme d'échantillon, est donnée par la formule suivante :
(formule non reproduite, voir au Journal officiel).
C et : concentration de la solution étalon (U.I./ml).
A et A ech : surfaces des pics de l'étalon et de l'échantillon.
I et I ech : volumes de l'injection de la solution étalon et de l'échantillon.
S et S ech : sensibilités du détecteur pour l'étalon et l'échantillon (Remarque 7.2).
Vi : volume d'extraction (250 ml dans la méthode).
Vr : volume prélevé après extraction (200 ml dans la méthode).
Vf : volume final après concentration (3 ml dans la méthode).
P : prise d'essai.
7. Remarques.
7.1. Pour la séparation de la vitamine D, la colonne de silice utilisée doit être très sélective. Si, à l'usage, la colonne ne donne pas la séparation souhaitée, on peut essayer de la régénérer en faisant passer 75 ml de chloroforme, puis 75 ml de méthanol, puis à nouveau 75 ml de chloroforme. Restabiliser la colonne avec la phase mobile.
7.2. Si la mesure des surfaces s'effectue à l'aide d'un intégrateur branché sur la sortie intégration du détecteur, ne pas tenir compte dans le calcul du rapport des sensibilités.
7.3. Dans le cas des aliments humides où les teneurs en vitamine D sont souvent très faibles, il est recommandé de prendre toutes les précautions analytiques, lorsqu'un dossier sera susceptible d'être présenté au Parquet.