Article Annexe AUTONOME VIGUEUR, en vigueur depuis le (Arrêté du 12 novembre 1986 relatif aux méthodes officielles de dosage des vitamines A, D et E dans les aliments pour animaux familiers)
Article Annexe AUTONOME VIGUEUR, en vigueur depuis le (Arrêté du 12 novembre 1986 relatif aux méthodes officielles de dosage des vitamines A, D et E dans les aliments pour animaux familiers)
1. Objet et domaine d'application.
La présente méthode a pour objet de doser le rétinol (vitamine A) dans les aliments secs ou humides pour animaux familiers.
2. Principe.
Hydrolyse à chaud de l'échantillon par une solution d'hydroxyde de potassium en milieu éthanolique. Extraction par l'éther de pétrole. Dosage de la vitamine A contenue dans cet extrait par chromatographie liquide haute performance (C.L.H.P.) sur colonne de gel de silice et détection U.V.
Les formes trans, 13 - cis et 9 - cis du rétinol sont séparées.
3. Réactifs.
Les réactifs doivent être de qualité analytique. L'eau utilisée doit être de l'eau distillée ou de l'eau de pureté au moins équivalente.
3.1. Ethanol à 95 p. 100 vol.
3.2. Solution à 20 p. 100 (m/v) de pyrogallol dans l'éthanol (3.1).
3.3. Solution 0,5 M de sulfure de sodium dans la glycérine à 70 p. 100 (v/v).
3.4. Solution à 50 p. 100 (m/v) d'hydroxyde de potassium.
3.5. Ether de pétrole (ébullition 40 - 65 °C).
3.6. Phase mobile : mélange 99/1 (v/v) d'isooctane et d'alcool isopropylique.
3.7. Acétate de trans-rétinol.
3.8. Solution étalon de trans-rétinol.
Préparation :
Mettre dans un ballon de 250 ml une prise d'essai d'acétate de trans-rétinol contenant environ 15 000 à 20 000 U.I. de rétinol, ajouter 5 ml de solution de pyrogallol (3.2), 35 ml d'éthanol (3.1) et 10 ml de solution d'hydroxyde de potassium (3.4). Chauffer durant trente minutes à 70 - 80 °C sous réfrigérant à reflux et laisser ensuite refroidir sous courant d'eau. Ajouter 40 ml d'eau et 100 ml d'éther de pétrole (3.5). Extraire par agitation deux à trois minutes. Laisser décanter dans le ballon. Transvaser la phase supérieure dans une ampoule à décanter (4.3). Laver cette phase éthérée jusqu'à neutralité avec des fractions de 50 ml d'eau et la sécher à l'aide de bandes de papier filtre. Dans deux fioles jaugées de 50 ml faire, à la pipette, deux prélèvements de 5 ml de la phase éthérée.
Compléter à 50 ml avec de l'éther de pétrole la première fiole. Evaporer sous courant d'azote le contenu de la deuxième fiole et compléter ensuite à 50 ml avec de l'alcool isopropylique. La concentration en rétinol de cette solution sera déterminée par la mesure de sa densité optique à 325 nm : C (U.I./ml) =
18,3 X D.O..
C'est la solution éthérée contenue dans la première fiole qui sera injectée dans le chromatographe.
4. Appareillage.
Matériel courant de laboratoire et notamment :
4.1. Rampe de chauffage (chauffe-ballon ou bain d'eau) avec réfrigérants à rodage.
4.2. Ballons de 500 ml à rodage adaptable aux réfrigérants.
4.3. Ampoules à décanter de 500 ml.
4.4. Appareil rotatif à évaporation sous vide.
4.5. Appareil de C.L.H.P. avec détection par absorption U.V..
4.6. Colonne de gel de silice 10 mm (longueur 30 cm ; diamètre intérieur 4 mm) ou système équivalent donnant des facteurs de capacité de la colonne (k') de l'ordre de 3,7 pour le 13 - cis, 4,1 pour le 9 - cis et 5,3 pour le trans.
4.7. Spectrophotomètre.
5. Mode opératoire.
5.1. Préparation de l'échantillon pour essai.
5.1.1. Cas des produits secs :
Tout ou partie de l'échantillon est broyé de façon à pouvoir passer à travers les mailles d'un tamis de 1 mm d'ouverture. Homogénéiser.
5.1.2. Cas des aliments humides.
Tout ou partie de l'échantillon est haché finement. Homogénéiser.
Note - Les échantillons doivent être traités juste avant l'analyse. L'analyse ne doit pas être effectuée en lumière directe.
5.2. Hydrolyse et extraction.
Introduire 25 g de l'échantillon préparé et pesé à 0,01 g près dans un ballon de 500 ml (4.2). Ajouter successivement 10 ml de solution de pyrogallol (3.2), 4 ml de solution de sulfure de sodium (3.3), 70 ml d'éthanol (3.1) et 20 ml de solution d'hydroxyde de potassium (3.4). Chauffer durant trente minutes à 70 - 80 °C sous réfrigérant à reflux et laisser ensuite refroidir sous courant d'eau. Ajouter 80 ml d'eau et 100 ml d'éther de pétrole (3.5). Extraire par agitation une à deux minutes. Laisser décanter dans le ballon. Verser la phase organique supérieure dans une ampoule à décanter de 500 ml. Récupérer dans le ballon la phase aqueuse qui serait passée dans l'ampoule. Extraire encore deux fois dans le ballon par des fractions de 100 ml d'éther. Laver la phase organique obtenue après les extractions jusqu'à neutralité et éliminer les traces d'eau à l'aide de bandes de papier filtre. Evaporer à sec ainsi que l'éther servant à rincer l'ampoule. Reprendre le résidu sec par 25 ml d'éther exactement mesurés. C'est cet extrait qui sera injecté dans le chromatographe.
5.3. Conditions de la chromatographie liquide haute performance :
Débit de la phase mobile : 2 ml/minute ;
Longueur d'onde de détection : 325 nm avec une lampe au Deutérium ou filtre à 313 nm avec lampe à vapeur de mercure ;
Sensibilité du détecteur : 0,020 ;
Volumes injectés : 10 ml pour l'étalon et la quantité appropriée de la solution obtenue en 5.2.
6. Mode de calcul et formule.
La teneur en vitamine A, exprimée en Unités Internationales par gramme d'échantillon, est donnée par la formule suivante :
(formule non reproduite, voir au Journal officiel).
Cet : concentration de la solution étalon calculée selon 3.7.
Aet : surface du pic de l'étalon.
Aech. Cis- Aech. trans : surfaces des pics du cis et du trans-rétinol de l'échantillon.
Iet - Iech : volumes de l'injection de la solution étalon et de l'échantillon.
Set - Sech : sensibilités du détecteur pour l'étalon et l'échantillon (remarque 7.1).
Vf : volume final (25 ml dans la méthode).
P : prise d'essai.
0,815 : facteur correctif pour le cis rétinol : rapport des absorbances et activité (0,75/0,92) (remarque 7.2).
7. Remarques.
7.1 Si la mesure des surfaces s'effectue à l'aide d'un intégrateur branché sur la sortie intégration du détecteur, ne pas tenir compte dans le calcul du rapport des sensibilités.
7.2 Les colonnes de gel de silice permettent de séparer la 13 - cis rétinol, 9 - cis rétinol et le trans-rétinol. Le 9 - cis peut être négligé car lorsqu'il est présent, il est en faible quantité. Il est très difficile d'avoir un étalon de 13 - cis rétinol, cet isomère sera donc dosé à l'aide de l'étalon de trans-rétinol. On tiendra compte pour le calcul du 13 - cis rétinol de sa différence d'absorbance avec le trans et de son activité vitaminique qui n'est que de 75 p. 100 de celle du trans.