Instructions relatives aux antiglobulines humaines (AGH)
Les réactifs antiglobulines humaines sont rangés en deux catégories : les antiglobulines polyvalentes et les antiglobulines spécifiques. Les antiglobulines polyvalentes doivent avoir une activité anti-IgG et anti-complément : les antiglobulines spécifiques doivent reconnaître de manière spécifique les composants pour lesquels ils sont désignés "spécifiques". Toutes les antiglobulines doivent répondre aux normes de spécificité et d'activité.
Normes minimales exigibles.
Spécificité :
L'antiglobuline ne doit pas agglutiner, dans la technique choisie, des globules rouges humains mis en présence de sérums humains normaux dépourvus d'anticorps anti-érythrocytaires et des globules rouges humains non sensibilisés, qu'ils soient traités ou non par des enzymes protéolytiques (trypsinés). Ce contrôle devra au total être effectué sur un panel de 10 échantillons de globules rouges dont trois de groupe A, trois de groupe O, deux de groupe B et deux de groupe AB testés contre l'antiglobuline aux dilutions 1/1, 1/2, 1/4.
Le sang destiné à ce panel ne devrait pas être prélevé plus de trois jours auparavant. Les globules rouges doivent être conservés dans leur propre plasma. L'anticoagulant doit être l'ACD, le CPD ou l'EDTA. Le test à l'antiglobuline pratiqué sur ces globules rouges à l'aide d'une antiglobuline connue ne doit pas être positif.
Etude du spectre d'activité :
1° En premier lieu, il ne doit pas exister d'effet de zone ; le titrage de l'antiglobuline ne doit faire apparaître aucune prozone dans un quelconque des systèmes tests ci-après, la prozone étant définie par l'absence d'agglutination à la concentration de la présentation de l'antiglobuline et la présence d'une agglutination aux dilutions suivantes ;
2° En fonction de leur spécificité, les antiglobulines doivent répondre aux caractéristiques suivantes :
Antiglobulines polyvalentes : activité anti-IgG et activité anti-complément conformes aux normes ;
Antiglobulines anti-IgG : activité anti-IgG conforme aux normes et absence d'activité anti-complément ;
Antiglobulines anti-complément : activité anti-complément conforme aux normes et absence d'activité anti-IgG ;
Pour les autres antiglobulines à spectre encore plus étroit, le même type de contrôle doit être effectué pour le respect du spectre.
Les normes minimales sont les suivantes :
Activité anti-IgG.
|
SYSTÈMES-TESTS |
INTENSITÉ |
TITRE |
|
Globules rouges D+ (DCcee)/anti-D |
+++ |
128 |
|
Globules rouges K+ (k+ k+)/anti-K |
+++ |
16 |
|
Globules rouges Fy (a+), Fy (a+ b+)/anti-Fy a |
++ |
8 |
|
Globules rouges Jk (a+), Jk (a+ b+)/anti-Jk a (prélèvements effectués sur EDTA) |
++ |
8 |
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Globules rouges d'anémie hémolytique auto-immune de type IgG isolé |
++ |
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Activité anti-complément.
|
SYSTÈMES-TESTS |
INTENSITÉ |
TITRE |
|
Globules rouges Jk (a+), Jk (a+ b+)/anti-Jk a (en présence de complément) |
++ |
8 |
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Globules rouges Le (a+), Le (a+ b-)/anti-Le a (en présence de complément) |
+++ |
16 |
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Globules rouges revêtus de complément (C 3, C 4) |
+++ |
16 |
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Globules rouges de maladies des agglutinines froides |
++ |
- |
|
Globules rouges d'anémie hémolytique auto-immune de type complément isolé |
++ |
- |
Les recommandations techniques de préparation des anticorps de référence et les techniques de sensibilisation sont précisées ci-dessous.
Techniques de sensibilisation :
Pour les anticorps anti-D, anti-Fy a, anti-Jk a et anti-K :
incubation à 37 degrés C durant 45 minutes d'un mélange d'un volume de sérum et un volume de globules rouges en suspension saline à 5 % suivie d'un minimum de trois lavages (sérums traités par EDTA).
Pour l'anti-Lea : l'étape précédente, qui, selon la nature de l'anti-corps pourrait également s'effectuer à 16 degrés C ou à 22 degrés C, sera suivie par l'incubation à 37 degrés C durant 20 minutes des globules rouges ainsi sensibilisés et débarrassés du surnageant sérique après centrifugation, avec 1 ml de complément humain (sérum AB frais). La phase de fixation du complément est identique pour l'anti-Jk a.
Pour la mise en évidence des fractions du C3 et C4, on pratiquera le test au sucrose : à une goutte (50 microns de l) de culot globulaire (pool A, B et O) on ajoute deux gouttes de sérum humain frais sélectionné et 4 ml de la solution suivante : sucrose pur : 6 g ; Nacl : 0,15 g pour 100 ml d'eau distillée. L'ensemble est incubé pendant quinze minutes à 37 degrés C. Les globules rouges sont utilisés après trois lavages. Ils ne doivent pas être autoagglutinables en milieu salin, ni en milieu sérique. Les globules rouges ainsi préparés peuvent alors être incubés en présence de trypsine à 0,1 % à 37 degrés C pendant quinze minutes pour transformer le C3b en C3d et le C4 en C4d. D'autres techniques peuvent être utilisées pour l'analyse spécifique du C3d, C3b. D'autres techniques plus spécifiques peuvent être utilisées.
Les caractéristiques des réactifs utilisés :
Les sérums utilisés pour la sensibilisation in-vitro des globules rouges doivent répondre aux critères maximums d'intensité et de titre, indiqués dans le tableau suivant :
|
SYSTÈMES-TESTS |
INTENSITÉ |
TITRE |
|
Globules rouges O, DCcee/anti-D |
+++ |
64-128 |
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Globules rouges O, Fy (a+ b+)/anti-Fy a |
++ |
8-16 |
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Globules rouges O, K+ k+/anti-K |
++ |
16 |
|
Globules rouges O, JK (a+ b+)/anti-Jk a |
++ |
8-16 |
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Globules rouges O, Le (a+ b-)/anti-Le a complément humain |
+++ |
16 |
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Globules rouges testés par le sucrose/sérum AB |
+++ |
16 |
Ces valeurs doivent être obtenues par la technique de test à l'antiglobuline utilisant une antiglobuline conforme, servant de référence et conservé au CNRGS. Les dilutions des sérums pour le titrage se font en saline. Pour les sérums anti-Le a et anti-Jk a, il est nécessaire, au terme du temps de sensibilisation, de retirer après centrifugation le surnageant sérique et de le remplacer par un volume égal de sérum AB frais, source de complément. Les lavages et le test à l'antiglobuline proprement dit n'interviendront qu'après vingt minutes d'incubation supplémentaire à 37 degrés C de ce nouveau mélange.
Les techniques du test à l'antiglobuline proprement dit et du contrôle de la spécificité du réactif AGH sont celles décrites dans l'annexe I.