Article Annexe II AUTONOME ABROGE, en vigueur du au (Arrêté du 21 décembre 1979 relatif aux critères microbiologiques auxquels doivent satisfaire certaines denrées animales ou d'origine animale)
Article Annexe II AUTONOME ABROGE, en vigueur du au (Arrêté du 21 décembre 1979 relatif aux critères microbiologiques auxquels doivent satisfaire certaines denrées animales ou d'origine animale)
1. Préparation de l'échantillon pour essai - Prise d'essai.
Chaque fois qu'il est nécessaire, il est procédé à une homogénéisation du produit à l'aide de techniques et d'appareils appropriés (broyeur-homogénéisateur par exemple).
Les prises d'essai sont effectuées sur l'échantillon homogénéisé en tenant compte de la nature des produits et des opérations analytiques à conduire. Elles sont en principe de 10, 25 ou 50 grammes (dans ce dernier cas 25 grammes sont réservés à la recherche des salmonelles).
2. Suspensions mères et dilutions décimales.
Dans un flacon taré contenant 90, 100 ou 225 ml de diluant, introduire aseptiquement 10 ou 25 grammes de produit afin de réaliser des suspensions au 1/5 ou 1/10. Homogénéiser.
Les diluants suivants sont préconisés :
2.1. Cas général.
Tryptone sel :
Tryptone : 1 g
Chlorure de sodium : 8,5 g
Eau distillée : 1000 ml
Préparation : chauffer lentement jusqu'à complète dissolution, ajuster si nécessaire le pH à 7,0 (+ 0,1), répartir, puis stériliser vingt minutes à 121 degrés C plus ou moins 1.
Eau peptonée tamponnée :
Bacto peptone : 20 g
Chlorure de sodium : 5 g
Phosphate disodique : 9 g
Phosphate monopotassique : 1,5 g
Eau distillée : 1000 ml.
Stériliser à 121 degrés C plus ou mins 1 pendant vingt minutes ; pH final : 7,2.
2.2. Cas des produits laitiers.
Eau peptonée pour le yaourt.
Tryptone-sel pour les laits gélifiés et emprésurés.
Phosphate dipotassique à 2 p. 100 (pH final entre 7,4 et 7,6) pour les crèmes fraîches, les fromages frais et les caséinates.
A partir des suspensions mères, préparer les dilutions décimales en utilisant le diluant correspondant au produit à analyser.
3. Revivification.
A l'exclusion des produits laitiers, si le produit a subi un traitement thermique ou s'il a été congelé ou encore s'il renferme des sels pouvant exercer une action inhibitrice (Na Cl, Na NO 3, Na NO 2...) après homogénéisation laisser le flacon à la température du laboratoire (20 degrés C plus ou moins 2 degrés C) pendant trente à quarante-cinq minutes (optimum quarante minutes).
4. Dénombrement des micro-organismes aérobies à 30 degrés C.
Porter en double 1 ml de l'échantillon pour essai s'il est liquide ou 1 ml de la suspension mère dans le cas des autres produits, dans les boîtes de Pétri stériles (90 à 100 mm de diamètre). Pratiquer de la même manière à partir des dilutions retenues en fonction du produit à analyser.
Couler dans chaque boîte 15 ml de gélose pour dénombrement préalablement fondue et ramenée à 47 degrés C (plus ou moins 1 degré C). Bien mélanger inoculum et milieu. Laisser solidifier.
L'ensemble de ces opérations ne doit pas durer plus de quinze minutes.
Nota - Il est indispensable d'employer des pipettes stériles changées pour chaque dilution et d'homogénéiser à l'aide d'un agitateur pour tubes à essai.
Placer les boîtes retournées dans une étuve à 30 degrés C (plus ou moins 1 degré C). Les laisser soixante-douze heures (plus ou moins 1 degré C) plus ou moins trois heures.
Ne retenir pour le dénombrement que les boîtes contenant moins de 300 colonies (et plus de 30 si possible).
En cas d'expertise, se conformer aux dispositions de la norme Afnor V 08-011.
5. Dénombrement des Enterobacteriaceae.
Le dénombrement s'effectue en gélose au cristal violet, rouge neutre, bile, glucose (V.R.B.G.).
A partir du flacon contenant la suspension mère (1/5 ou 1/10) porter 1 ml dans deux boîtes de Pétri stériles (90 à 100 mm de diamètre).
Couler 12/13 ml de gélose sélective fondue et ramenée à 47 degrés C (plus ou moins 1 degré C). Bien mélanger inoculum et milieu. Laisser solidifier. Couler en surface environ 9 ml de milieu sélectif vierge ramené à 47 degrés C (plus ou mins 1 degré C). Laisser solidifier et placer les boîtes retournées dans une étuve à 30 degrés C (plus ou moins 1 degré C). Les laisser vingt-quatre heures (plus ou moins 2 heures). Dénombrer les colonies violettes et vérifier la nature de ces colonies (les entérobactéries sont oxydases et fermentent le glucose).
6. Dénombrement des coliformes.
Les coliformes sont dénombrés soit en milieu solide (gélose désoxycholate lactose), soit en milieu liquide par la technique du nombre le plus probable (N.P.P.) à l'aide du bouillon lactosé bilié au vert brillant réparti dans des tubes contenant des cloches de Durham (10 ml de bouillon par tube).
6.1. Le dénombrement en milieu solide s'effectue à partir du produit s'il est liquide, des suspensions mères dans les autres cas et des dilutions décimales retenues selon la nature du produit en portant 1 ml dans deux boîtes de Pétri stériles (90-100 mm de diamètre).
Couler ensuite 13 ml environ de gélose désoxycholate lactose fondue et ramenée à 47 degrés C (plus ou moins 1 degré C). Bien mélanger inoculum et milieu. Laisser solidifier. Recouvrir d'une couche de gélose désoxycholate lactose vierge (9 ml environ), laisser solidifier.
Porter les boîtes retournées à l'étuve à 30 degrés C (plus ou moins 1 degré C). Les laisser vingt-quatre heures (plus ou moins deux heures).
Dénombrer les colonies caractéristiques rouge foncé d'un diamètre supérieur à 0,5 mm en prenant si possible une série de deux boîtes où le nombre est compris entre 15 et 150.
6.2. Le dénombrement en milieu liquide s'effectue en transférant dans trois tubes de milieu sélectif 1 ml du produit s'il est liquide ou de la suspension mère, puis en opérant de la même manière pour les dilutions suivantes :
Bien mélanger inoculum et milieu.
Porter les tubes à l'étuve à 30 degrés C (plus ou moins 1 degré C). Les laisser vingt-quatre - quarante huit heures (plus ou moins deux heures).
Pour chaque dilution (y compris suspension mère et produit liquide) compter les tubes positifs, c'est-à-dire ceux qui présentent un dégagement gazeux dans la cloche de Durham et calculer le nombre le plus probable à l'aide des tables de référence.
En cas d'expertise, se conformer aux indications des normes Afnor V 08-015 et V 08-016.
7. Dénombrement des coliformes fécaux.
(Entérobactéries fermentant le lactose aux températures élevées). Il s'effectue :
Soit en milieu solide, selon les mêmes modalités que pour les coliformes mais en portant les boîtes de Pétri ensemencées à + 44 degrés C (plus ou moins 0,5 degré C) durant vingt-quatre heures (plus ou moins deux heures) ;
Soit en milieu liquide (technique du N.P.P. en repiquant à l'aide d'une anse bouclée les tubes de bouillon lactosé bilié au vert brillant trouvés positifs lors du dénombrement des coliformes, dans des tubes de ce même bouillon.
Les tubes ensemencés sont incubés en bain d'eau à 44 degrés C (plus ou moins 0,5 degré C) vingt-quatre - quarante huit heures (plus ou moins deux heures).
Compter les tubes positifs, c'est-à-dire ceux présentant un dégagement gazeux dans les cloches de Durham et calculer le nombre le plus probable à l'aide des tables de référence.
8. Dénombrement de Staphylococcus aureus.
A partir du produit, s'il est liquide, de la suspension mère et/ou des dilutions retenues selon la nature du produit, porter 0,1 ml sur deux boîtes de Pétri contenant du milieu de Baird Parker et étaler l'inoculum à l'aide d'un étaleur de verre stérile sur la surface préalablement séchée du milieu. Ce dernier ne doit pas avoir plus de quarante-huit heures et doit être conservé au froid. Pour les produits laitiers, ensemencer 1 ml en milieu du Baird Parker.
Les boîtes sont incubées à l'étuve à 37 degré C (plus ou moins 1 degré C) pendant vingt-quatre puis quarante-huit heures.
Dénombrer les colonies caractéristiques, c'est-à-dire noires, brillantes, d'un diamètre compris entre 0,5 et 2 mm, présentant un liseré blanc opaque, entourées d'une auréole d'éclaircissement du milieu. Certains staphylocoques retrouvés dans les produits laitiers peuvent donner des colonies noires dépourvues d'auréole.
Repiquer au moins cinq colonies pour les soumettre aux tests de la coagulase ou de la thermonucléase.
En cas d'expertise, se conformer aux indications de la norme Afnor V 08-014.
9. Dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs (à 46 degrés C). Ce dénombrement peut s'effectuer en milieu S.P.S., T.S.N. ou T.S.C. (Tryptone Sulfite Cyclosérine), ce dernier milieu étant recommandé. En raison de sa relative nouveauté, sa composition est rappelée ci-après :
Préparation du milieu base :
Tryptone : 15 g
Soytone : 5 g
Extrait de levure : 5 g
Métabisulfite de sodium anhydre (S2 O5 Na2) : 1 g
Citrate de fer ammoniacal : 1 g
Agar-agar : 12 g à 18 g
Eau : 1000 ml
Ajuster le pH de sorte qu'après stérilisation il soit à 7,6 égal ou supérieur à 0,1 à 25 degrés C. Répartir en tubes de 20 x 200 à raison de 19 ml par tube. Stériliser quinze minutes à 121 degrés C) plus ou moins 1 degré C. Conserver à 4-5 degrés C au maximum quinze jours.
Solution de D cyclosérine :
D cyclosérine cristallisée : 4 g
Eau : 100 ml
Dissoudre la cyclosérine dans l'eau. Stériliser par filtration. Préparation du milieu complet :
Au moment de l'emploi, ajouter la solution de D cyclosérine pour obtenir une concentration finale de 400 microns de gramme/ml soit 1 ml pour 100 ml de milieu soit 0,20 pour 20 ml ou 0,25 pour 0,25 ml de milieu.
10. Dénombrement des streptocoques fécaux.
(Ne concerne que les produits de la pêche).
Il s'effectue en milieu liquide par la technique du nombre le plus probable (N.P.P.).
Ensemencer successivement trois tubes de milieu de Rothe avec 1 ml de suspension mère ou des différentes dilutions au 1/20, 1/200, 1/2000 (trois tubes par dilution).
Faire incuber les tubes 37 degrés C (plus ou moins 1 degré C) vingt-quatre - quarante-huit heures.
Repiquer les tubes positifs, c'est-à-dire ceux montrant une croissance bactérienne, dans des tubes contenant du milieu de Litsky (une anse bouclée).
Faire incuber les tubes 37 degrés C (plus ou moins 1 degré C) vingt-quatre - quarante huit heures.
Compter les tubes positifs (troubles et/ou avec pastille violette au fond des tubes) pour chaque dilution et calculer le N.P.P. en utilisant les tables de référence.
11. Recherche des Salmonella.
En cas d'expertise se conformer aux indications de la norme Afnor V 08-013. Dans les autres cas, utiliser la technique suivante :
Préenrichissement : s'effectue en eau peptonée tamponnée (Voir annexe 2, 2 1), pendant quatre heures à 37 degrés C (plus ou moins 1 degré C) pour les ovoproduits et ceux dont la teneur microbienne initiale est présumée importante, et pendant seize à vingt heures à 37 degrés C (plus ou moins 1 degré C) dans les autres cas.
Le rapport entre la prise d'essai et le volume du milieu doit être 1/10.
Enrichissement : à partir du milieu de préenrichissement, porter 2 ml :
Dans deux tubes de bouillon Muller Kauffmann au tétrathionate et vert brillant (20 ml par tube).
Dans deux tubes de bouillon au sélénite (20 ml par tube).
Faire incuber à 37 degrés C (plus ou moins 1 degré C) : un tube de bouillon au tétrathionate et un tube de bouillon au sélénite.
Isolement :
Après vingt-quatre heures et éventuellement quarante-huit heures d'incubation, effectuer, à partir des milieux d'enrichissement, des isolements à la surface de géloses au vert brillant et au rouge de phénol et, si possible, à la surface d'un deuxième milieu sélectif. Faire incuber les boîtes à 37 degrés C (plus ou moins 1 degré) pendant vingt heures (plus ou moins deux heures). Si le développement est insuffisant, poursuivre l'incubation.
S'il y a présence de colonies caractéristiques ou douteuses, en repiquer un nombre suffisant et les soumettre aux essais biochimiques classiques.
Adresser les souches repiquées sur gélose nutritive au service des entérobactéries du laboratoire central d'hygiène alimentaire, 43, rue de Dantzig, 75015 Paris.
Nota - Dans l'éventualité où l'analyse porte sur de nombreux échantillons d'un même lot, une technique simplifiée peut être mise en oeuvre.
Elle comporte :
Préenrichissement (sans changement) ;
Enrichissement :
Un tube de bouillon tétrathionate incubé à 43 degrés C (plus ou moins 0,5 degré C) ;
Isolement :
Sur gélose au vert brillant et rouge de phénol seulement.
Remarques générales.
Expression des résultats.
Les résultats des dénombrements doivent être rapportés au gramme ou au millilitre. En cas de recherche, le poids ou le volume d'inoculum doit être précis.
Valeur de certains résultats.
En milieu solide les dénombrements donnant un nombre de colonies inférieur à 10 ne peuvent conduire qu'à une approximation numérique de la contamination d'un gramme de produit. Dans ce cas, il convient d'exprimer le nombre de colonies observées pour l'inoculum réellement utilisé.
Milieux de culture.
Afin d'améliorer la fidélité des résultats, il est recommandé d'utiliser les milieux complets déshydratés ou des composants de base déshydratés et de suivre scrupuleusement les prescriptions du fabricant.