Article Annexe AUTONOME VIGUEUR, en vigueur depuis le (Arrêté du 2 septembre 1983 METHODES OFFICIELLES D'ANALYSES RELATIVES A LA DETECTION DES ANTIBIOTIQUES ET DES SULFAMIDES DANS LES LAITS DESTINES A L'ALIMENTATION HUMAINE ET ANIMALE.(METHODES DECRITES EN ANNEXE))
Article Annexe AUTONOME VIGUEUR, en vigueur depuis le (Arrêté du 2 septembre 1983 METHODES OFFICIELLES D'ANALYSES RELATIVES A LA DETECTION DES ANTIBIOTIQUES ET DES SULFAMIDES DANS LES LAITS DESTINES A L'ALIMENTATION HUMAINE ET ANIMALE.(METHODES DECRITES EN ANNEXE))
5. Appareillage et verrerie.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie et notamment :
5. 1. Etuves à 30 plus ou moins 1 degré C, à 37 plus ou moins 1 degré C, à 55 plus ou moins 1 degré C.
5. 2. Congélateur dont la température doit être inférieure ou égale à-25 degrés C.
5. 3. Bains d'eau réglables à 80 plus ou moins 1 degré C et à 100 degrés C.
5. 4. Bains d'eau réglables à 40 plus ou moins 1 degré C, à 45 plus ou moins 0, 5 degré C et à 55 plus ou moins 1 degré C.
5. 5. Centrifugeuse réfrigérée permettant d'opérer à 3 degrés C et à une vitesse d'environ 5000 g.
5. 6. Agitateur électrique pour tubes à essai.
5. 7. Agitateur électromagnétique avec barreau aimanté stérilisable.
5. 8. Flacons col à vis d'une capacité de 125 ml.
5. 9. Flacons gradués à 1000 ml.
5. 10. Fioles de Roux de 1000 ml.
5. 11. Fioles d'Erlenmeyer de 150 ml.
5. 12. Fioles jaugées de 100 ml et de 1000 ml.
5. 13. Tubes à essai de 16 x 160 mm, de 18 à 180 mm avec et sans bouton à vis et de 20 x 200 mm.
5. 14. Tubes de centrifugation d'une capacité d'environ 50 ml.
5. 15. Pipettes de 10 ml graduées en 0, 5 ou 0, 1 ml.
5. 16. Pipettes de 2 ml et 1 ml graduées en 0, 1 ml.
5. 17. Billes de verre d'un diamètre d'environ 5 mm.
5. 18. Boîtes de Petri, en verre ou en matière plastique, d'un diamètre de 100 mm, à fond parfaitement plat.
5. 19. Disques de papier filtre d'un diamètre de 9 mm, de qualité répondant aux exigences du mode opératoire.
5. 20. Papier filtre stérile.
5. 21. Pince à bouts pointus.
5. 22. Balance de précision analytique.
5. 23. pH mètre (permettant de mesurer le pH des milieux et réactifs préparés avec une précision de réglage de plus ou moins 0, 1 unité de pH à 25 degrés C).
5. 24. Anse bouclée en nickel chrome.
6. Préparation des micro-organismes sensibles.
6. 1. Méthode d'acidification :
Organisme test : Streptococcus thermophilus souche TJ.
Cette souche est disponible au Laboratoire de Biochimie et Technologie Laitières CNRZ, 78350 Jouy-en-Josas.
6. 1. 1. Cultures de réserve.
Une culture lyophilisée de Streptococcus thermophilus est réhydratée puis remise en activité par trois repiquages successifs dans le lait stérile (4. 2. 1) avec incubation à 37 degrés C (5. 1) pendant seize à dix-huit heures.
La culture ainsi obtenue sert à ensemencer, à raison de 2 %, des tubes de lait stérile (4. 2. 1) qui sont placés ensuite dans un congélateur (5. 2). Ils constituent des " cultures de réserve " qui peuvent être utilisées pendant trois mois au maximum.
6. 1. 2. Culture d'épreuve.
La veille de l'examen, décongeler un tube de culture de réserve en le plaçant dans un bain d'eau à 40 degrés C environ. Après agitation, incuber à l'étuve à 37 degrés C pendant seize à dix-huit heures. La culture ainsi obtenue doit être coagulée sans présenter d'exsudation de sérum. La culture d'épreuve est préparée en mélangeant aseptiquement :
-10 ml de la culture précédente dont a désagrégé le coagulum par agitation à l'aide d'un agitateur électrique (5. 6).
-5 ml de solution d'extrait de levure (4. 2. 2).
-10 ml de la solution de pourpre de bromocrésol (4. 2. 3).
6. 2. Méthodes de confirmation.
6. 2. 1. Technique de diffusion à l'aide de Bacillus stearothermophilus (méthode de Galeslott et Hassing).
Organisme test : Bacillus stearothermophilus variété calidolactis souche C 953.
Cette souche est disponible au Laboratoire de Biochimie et Technique Laitières C.N.R.Z., 78350 Jouy-en-Josas.
6. 2. 1. 1. Culture pour remise en activité.
Une culture lyophilisée de Bacillus stearothermophilus est réhydratée puis remise en activité par trois repiquages successifs à l'aide d'une anse bouclée (5. 24) dans 10 ml de bouillon (4. 3. 1. 1) en fiole Erlenmeyer (5. 11) stérile avec incubation à l'étuve à 55 degrés C (5. 1) pendant seize heures.
6. 2. 1. 2. Cultures de réserve.
La culture obtenue précédemment sert à ensemencer en stries des tubes de gélose inclinée (4. 3. 1. 2).
Les tubes ensemencés sont placés pendant quarante-huit heures à l'étuve à 55 degrés C.
Ces cultures de réserve peuvent être conservées plusieurs mois au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C).
6. 2. 1. 3. Culture d'épreuve.
Une culture fraîche de l'organisme test est préparée la veille de l'essai. Inoculer une fiole contenant 10 ml de bouillon (4. 3. 1. 1) avec une anse de la culture décrite en 6. 2. 1. 1, à condition qu'elle ait été conservée au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C) pendant un délai n'excédant pas une semaine.
La fiole de bouillon ensemencé est placée à l'étuve à 55 degrés C pendant six heures au minimum et seize heures au maximum.
Lorsque l'on repart d'une culture de réserve, il est nécessaire d'effectuer au moins un repiquage intermédiaire selon le mode opératoire décrit ci-dessus.
6. 2. 1. 4. Préparation des boîtes de Petri.
La culture obtenue en 6. 2. 1. 3 sert à ensemencer le jour de l'essai le milieu gélose (4. 3. 1. 3).
Ce milieu gélosé, préalablement fondu puis refroidi à 55 degrés C est inoculé au moyen de la culture liquide de Bacillus stearothermophilus à raison d'une partie de celle-ci pour cinq parties de milieu. Le mélange est ensuite réparti, par fractions de 6 ml, dans des boîtes de Petri de 100 mm de diamètre (5. 18) préalablement réchauffées à l'étuve à 55 degrés C. Laisser solidifier le milieu sur une surface froide et horizontale.
Les boîtes ainsi préparées peuvent être utilisées dans un délai de deux jours au maximum à condition de les refroidir immédiatement après la préparation et de les conserver au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C).
6. 2. 2. Technique de diffusion à l'aide de Bacillus subtilis.
Organisme test : Bacillus subtilis ATCC 6633.
6. 2. 2. 1. Suspension de spores.
Utiliser des préparations commerciales de l'espèce donnée en référence.
6. 2. 2. 2. Etalonnage de la suspension de spores.
Chaque lot de suspension de spores doit être vérifié afin d'en déterminer la concentration. Le dénombrement des spores est effectué à partir des dilutions décimales de la suspension de spores, réalisées à l'aide du diluant (4. 3. 3. 2), utiliser le milieu gélosé (4. 3. 2. 1) et incuber les boîtes à l'étuve à 30 degrés C (5. 1) pendant vingt-quatre heures.
6. 2. 2. 3. Préparation des boîtes de Petri.
Le jour de l'épreuve, ensemencer la suspension de spores dans le milieu gélosé (4. 3. 2. 1), préalablement fondu puis refroidi à 55 degrés C, de façon à obtenir une concentration d'environ (5. 10 puissance 5) spores par ml de milieu.
Le milieu ensemencé est ensuite réparti, par fractions de 6 ml, dans des boîtes de Petri de 100 mm de diamètre (5. 18). Laisser solidifier le milieu sur une surface froide et horizontale.
Les boîtes ainsi préparées sont utilisées dans la journée ; entre-temps les conserver au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C).
6. 2. 3. Technique de diffusion à l'aide de Bacillus megaterium.
Organisme test : Bacillus megaterium ATCC 9885.
Cette souche est disponible au Laboratoire de Biochimie et Technologie Laitières C.N.R.Z., 78350 Jouy-en-Josas.
6. 2. 3. 1. Culture pour remise en activité.
Une culture lyophilisée de la souche est réhydratée puis remise en activité par culture sur un tube de gélose inclinée de Mueller-Hinton (4. 3. 3. 3).
Incuber à l'étuve à 37 degrés C (5. 1) pendant seize à dix-huit heures.
6. 2. 3. 2. Préparation de la suspension de spores.
Récolter la culture développée sur gélose inclinée à l'aide de 2 ml de la solution tampon diluée (4. 3. 3. 1).
Transférer la suspension obtenue à la surface du milieu gélosé de sporulation (4. 3. 3. 5) réparti en boîtes de Roux (5. 10).
Introduire une vingtaine de billes de verre stériles (5. 17) pour permettre de répartir l'inoculum et faciliter la récolte de la culture de Bacillus megaterium après incubation.
Incuber à l'étuve à 37 degrés C pendant 4 jours.
Recueillir la culture à l'aide de 50 ml de solution tampon diluée (4. 3. 3. 1).
Centrifuger la suspension de spores à 3000-5000 g pendant 15 minutes à 3 degrés C. Eliminer le surnageant, répéter le lavage trois fois.
Reprendre le culot avec 50 ml de solution tampon diluée.
La suspension de spores dans la solution tampon diluée est conservée au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C) pendant 6 mois au maximum.
6. 2. 3. 3. Etalonnage de la suspension de spores.
Chaque lot de suspension de spores doit être vérifié afin d'en déterminer la concentration. Le dénombrement des spores est effectué à partir des dilutions décimales de la suspension de spores, réalisées à l'aide du diluant (4. 3. 3. 2) utiliser le milieu gélosé de Mueller-Hinton (4. 3. 3. 3) et incuber les boîtes à l'étuve à 37 degrés C (5. 1) pendant quarante-huit heures.
6. 2. 3. 4. Préparation des boîtes Petri.
Le jour de l'épreuve, ensemencer la suspension de spores dans 100 ml de milieu gélosé de Mueller-Hinton additionné de triméthoprime (4. 3. 3. 4), préalablement fondu puis refroidi à 55 degrés C, de façon à obtenir une concentration d'environ (5. 10 puissance 5) spores par ml de milieu.
Ce mélange est ensuite réparti, par fractions de 5 ml, dans des boîtes de 100 mm de diamètre (5. 18). Laisser solidifier le milieu sur une surface froide et horizontale.
Les boîtes ainsi préparées sont utilisées dans la journée, entre-temps les conserver au réfrigérateur (0 à + 5 degrés C).