Article Annexe II AUTONOME ABROGE, en vigueur du au (Arrêté du 2 mai 1985 définissant les modalités techniques selon lesquelles sont prélevés et analysés les échantillons de laits livrés par les producteurs aux fins de la détermination de leur composition et de leur qualité)
Article Annexe II AUTONOME ABROGE, en vigueur du au (Arrêté du 2 mai 1985 définissant les modalités techniques selon lesquelles sont prélevés et analysés les échantillons de laits livrés par les producteurs aux fins de la détermination de leur composition et de leur qualité)
Les échantillons sont soumis au dénombrement de la flore totale sur milieu gélosé.
1. Méthode de référence.
Cette méthode est décrite dans l'arrêté du 21 juin 1982 modifié, relatif aux normes d'hygiène et de salubrité auxquelles doit répondre le lait pasteurisé conditionné.
2. Méthode simplifiée : méthode de l'anse calibrée.
2.1. Principe.
Ensemencement, à l'aide d'une anse métallique calibrée, d'un microlitre de lait dans un milieu de culture gélosé coulé en boîtes de Petri. Incubation de ces boîtes à 30 degrés C pendant soixante-douze heures.
Comptage des colonies et calcul du nombre de germes par millilitre de lait.
2.2. Matériel.
Matériel courant de laboratoire de microbiologie, et notamment :
2.2.1. Matériel d'ensemencement. Il se compose des éléments suivants (voir schéma) :
a) Anse calibrée permettant de prélever 1 micron de litre de lait, fabriquée suivant les spécifications de la norme expérimentale Afnor V 04-101, partie I.
Le calibrage de l'anse doit être vérifié fréquemment en déterminant le volume prélevé par la méthode décrite dans la norme expérimentale Afnor V 04-101, partie II.
Couder le fil de l'anse suivant un angle de 30 degrés, à environ 3 à 4 mm de l'anse. Tordre en plusieurs endroits l'extrémité du fil opposée à l'anse et introduire cette extrémité dans une canule (aiguille hypodermique de diamètre intérieur de 1,4 mm).
b) Seringue de 2 ml, réglée pour délivrer 1 ml, et équipée d'un dispositif de répartition en continu. Monter la canule portant l'anse calibrée sur la seringue.
c) Tube en caoutchouc de 0,3 cm de diamètre intérieur dont une extrémité est fixée sur la seringue, l'autre pénétrant dans un flacon contenant le diluant.
Nota - Le caoutchouc ne doit pas être inhibiteur.
d) Flacon contenant le diluant (2.3.2.).
2.2.2. Autoclave pouvant fonctionner à 121 plus ou moins 1 degré C.
2.2.3. Four à air chaud pouvant fonctionner jusqu'à 170 degrés C.
2.2.4. Bain d'eau bouillante.
2.2.5. Etuve permettant de maintenir une température uniforme de 30 plus ou moins 1 degré C.
2.2.6. pH-mètre, avec compensation de température, précis à 0,1 unité de pH à 25 degrés C.
2.2.7. Balance précise à 0,01 g.
2.2.8. Bain d'eau pouvant être maintenu à 45 plus ou moins 1 degré C.
2.2.9. Appareil de comptage de colonies comportant un système d'éclairage avec fond noir muni d'une loupe de grossissement 2-4 X et d'un compteur numérique.
2.2.10. Loupe de grossissement 8-10 X.
2.2.11. Flacons de 150 à 250 ml de capacité, ou tubes à essais d'environ 20 ml de capacité, munis d'un dispositif de fermeture approprié, capsules ou bouchons en caoutchouc ou en matière synthétique.
2.2.12. Flacons de 200 à 1000 ml de capacité.
2.2.13. Boîtes de Petri en verre non coloré, le fond des boîtes ayant un diamètre intérieur de 90 mm. La profondeur intérieure doit être de 10 mm au minimum. Le fond ne doit présenter aucune irrégularité qui interfère lors du dénombrement des colonies.
Note 1. - Des boîtes de Petri en matière plastique préstérilisées peuvent être utilisées à la place des boîtes de Petri en verre.
Note 2. - L'utilisation d'appareils réalisant l'ensemencement automatique ou semi-automatique des boîtes de Petri ainsi que d'appareils de comptage électronique des colonies peut être autorisée.
2.3. Diluant, milieu de culture et réactifs.
2.3.1. Composant de base.
Pour obtenir une bonne reproductibilité des résultats, il est recommandé d'utiliser, pour la préparation du diluant et du milieu de culture, des composants de base déshydratés ou des préparations complètes déshydratées. De même, les réactifs tout préparés du commerce peuvent être utilisés.
Les instructions du fabricant doivent être suivies scrupuleusement.
Les produits chimiques utilisés doivent être de qualité analytique.
L'eau utilisée doit être de l'eau distillée dans un appareil de verre ou de l'eau déionisée. Elle doit être exempte de substances susceptibles d'inhiber la croissance des micro-organismes dans les conditions de l'essai :
2.3.2. Diluant.
Composition :
Peptone : 1,0 g ;
Chlorure de sodium (NaCl) : 8,5 g ;
Eau : 1000 ml.
Préparation :
Dissoudre les composants dans l'eau, en chauffant si nécessaire.
Ajuster le pH de façon qu'après stérilisation il soit de 7,0 plus ou moins 0,1 à 25 degrés C.
Répartir par quantités de 100 à 500 ml dans des flacons de 200 à 1000 ml (2.2.12). Boucher au coton.
Stériliser à l'autoclave (2.2.2.) pendant quinze minutes à 121 plus ou moins 1 degré C.
Conserver les flacons de diluant pendant trois mois au maximum à l'obscurité et à une température ne dépassant pas + 5 degrés C.
Nota - La solution peptone-sel est le diluant choisi par l'Organisation internationale de normalisation (ISO). D'autres diluants peuvent être utilisés tels que, par exemple, la solution de Ringer au quart. Dans ce cas, le diluant peut être préparé à partir de pastilles disponibles dans le commerce.
2.3.3. Milieu de culture.
2.3.3.1. Composition :
Extrait de levure : 2,5 g ;
Tryptone : 5,0 g ;
Glucose (C6 H12 O6, lH2O) : 1,0 g ;
Agar-agar (selon les instructions du fabricant) : 12,0 à 18,0 g ;
Eau : 1000 ml.
Le pH après stérilisation doit être de 6,9 plus ou moins 0,1 à 30 degrés C.
2.3.3.2. Préparation à partir d'un milieu déshydraté commercial.
Suivre les instructions du fabricant. Ajuster si nécessaire le pH à 7,0-7,1 en utilisant la solution d'hydroxyde de sodium (2.3.4.1.) ou la solution d'acide chlorhydrique (2.3.4.2.) de façon à obtenir le pH requis après stérilisation.
2.3.3.3. Préparation à partir des ingrédients séparés.
Dissoudre dans l'ordre suivant : extrait de levure, tryptone et glucose. Le chauffage de l'eau facilite cette opération. Ajouter l'agar-agar et porter à ébullition en agitant fréquemment, jusqu'à ce que l'agar-agar soit complètement fondu, ou chauffer à la vapeur fluante pendant trente minutes environ.
Filtrer sur papier filtre si nécessaire.
Ajuster le pH, si nécessaire, à 7,0-7,1 en utilisant la solution d'hydroxyde de sodium (2.3.4.1.) ou la solution d'acide chlorhydrique (2.3.4.2.) pour obtenir le pH requis après stérilisation.
2.3.3.4. Répartition du milieu de culture.
Répartir le milieu préparé (2.3.3.2. ou 2.3.3.3.) dans les flacons (2.2.11) par quantités de 100 à 150 ml ou dans les tubes à essais (2.2.11) par quantités de 10 à 12 ml. Stériliser à l'autoclave (2.2.2.) pendant quinze minutes à 121 plus ou moins 1 degré C.
Vérifier le pH du milieu qui doit être de 6,9 plus ou moins 0,1 à 30 degrés C.
Conserver le milieu à l'obscurité à une température ne dépassant pas + 5 degrés C.
Le milieu ne doit pas être utilisé plus de trois mois après sa préparation.
2.3.4. Réactifs pour ajuster le pH.
2.3.4.1. Solution d'hydroxyde de sodium, environ 1 mol/l.
2.3.4.2. Solution d'acide chlorhydrique, environ 1 mol/l.
2.4. Mode opératoire.
2.4.1. Préparation de la verrerie.
Stériliser les boîtes de Petri dans le four à air chaud (2.2.3.) en les maintenant à 170 degrés C pendant au moins une heure ou, s'il n'y a pas de four à air chaud, à l'autoclave (2.2.2.) pendant quinze minutes à 121 plus ou moins 1 degré C.
2.4.2. Préparation du matériel d'ensemencement.
Stériliser tous les éléments du matériel d'ensemencement (2.2.1.) en les plaçant dans le bain d'eau bouillante (2.2.4.) pendant dix minutes ou par passage à l'autoclave à 121 degrés C pendant vingt minutes.
Après stérilisation, assembler le matériel comme indiqué sur le schéma : en respectant les règles d'asepsie, monter la canule sur la seringue et disposer le tuyau de caoutchouc dans un flacon de diluant (2.3.2.).
Enfoncer le piston de la seringue plusieurs fois afin de pomper le diluant dans la seringue.
Plonger l'anse dans une solution fraîchement préparée d'hypochlorite de sodium (50 mg/l de chlore actif). Expulser plusieurs portions de 1 ml de diluant, puis introduire une portion de 1 ml de diluant dans une boîte de Petri. Cette boîte constitue le témoin de stérilité du matériel d'ensemencement.
2.4.3. Fusion du milieu.
Avant de procéder à l'examen bactériologique des échantillons de lait, faire fondre rapidement la quantité requise de milieu dans le bain d'eau bouillante (2.2.4.) ou dans l'autoclave (2.2.2.) en vapeur fluante. Refroidir le milieu fondu dans le bain d'eau à 45 plus ou moins 1 degré C (2.2.8).
Nota. - Il est recommandé, pour contrôler la température de la gélose, de placer un thermomètre dans une solution d'agar-agar à 1,5 % contenue dans un flacon (ou tube) identique à celui utilisé pour le milieu. Cette solution témoin de température doit être chauffée et refroidie de la même façon que le milieu.
2.4.4. Préparation de l'échantillon.
Pour s'assurer d'une répartition uniforme des micro-organismes, mélanger soigneusement l'échantillon en retournant rapidement vingt-cinq fois le flacon. Il faut éviter toute inclusion d'air.
L'intervalle de temps séparant l'agitation de l'échantillon et le prélèvement à l'anse ne doit pas dépasser trois minutes.
Note - Un agitateur mécanique peut être utilisé pour réaliser l'agitation de l'échantillon.
2.4.5. Chargement de l'anse.
Plonger délicatement l'anse dans l'échantillon de lait. Introduire ainsi l'anse dans le lait à trois reprises, suivant un mouvement vertical uniforme de 30 mm d'amplitude. Chaque mouvement vertical doit durer une seconde.
On peut utiliser un métronome pour obtenir la vitesse correcte de retrait de l'anse de la surface du lait. Cette vitesse conditionne en effet le volume de lait prélevé.
Si l'on retire l'anse trop lentement, le volume de lait sera inférieur à 1 micron de litre, par contre si on retire l'anse brusquement, le volume de lait sera supérieur à 1 ul.
Il est nécessaire d'utiliser des flacons d'échantillons à large ouverture pour faciliter le retrait de l'anse et disposer d'un bon éclairage.
2.4.6. Ensemencement des boîtes de Petri.
Soulever le couvercle d'une boîte de Petri stérile (2.2.13), introduire l'anse et pousser le piston de façon que 1 ml de diluant passe à travers l'anse chargée et ainsi entraîne le lait dans la boîte. Ne pas pousser le piston trop rapidement, de façon que le diluant s'écoule le long du fil de platine et passe à travers l'anse.
Verser, dans chaque boîte ensemencée, 10 à 12 ml du milieu de culture fondu maintenu à 45 degrés C (2.4.3.). Mélanger immédiatement le milieu et l'inoculum par rotation de la boîte, de façon à obtenir, après incubation, des colonies uniformément réparties.
Laisser les boîtes sur une surface horizontale jusqu'à ce que le milieu soit solidifié.
Note 1 - L'expérience a montré qu'il n'est pas nécessaire de nettoyer l'anse entre deux échantillons.
Il faut éviter, en tout cas, de flamber l'anse pour ne pas la détériorer.
Examiner fréquemment l'anse pour détecter toute déformation ou la présence de substances étrangères.
Note 2 - L'intervalle de temps entre le chargement de l'anse et l'addition de gélose dans les boîtes de Petri ne doit pas dépasser quinze minutes. Les manipulations prévues aux points 2.4.4, 2.4.5. et 2.4.6 ne doivent pas être faites à la lumière solaire directe.
2.4.7. Incubation des boîtes de Petri.
Les boîtes sont retournées et mises à l'étuve à 30 degrés C (2.2.5.). Les piles de boîtes ne doivent pas se toucher ni être en contact avec les parois ou la partie supérieure de l'étuve.
Incuber les boîtes pendant 72 plus ou moins 2 heures.
2.4.8. Comptage des colonies.
Compter les colonies sur les boîtes de Petri, à l'aide de l'appareil de comptage (2.2.9).
Eviter de confondre les particules de substances non dissoutes ou précipitées avec des colonies de la taille d'une tête d'épingle. En cas de doute, examiner les colonies à l'aide d'une loupe de grossissement plus fort (2.2.10).
Les colonies envahissantes sont considérées comme des colonies uniques. Si moins d'un quart de la boîte est recouvert par des colonies envahissantes, compter les colonies sur la partie non affectée de la boîte et calculer le nombre correspondant pour la boîte entière. Si plus d'un quart de la boîte est recouvert par des colonies envahissantes, éliminer la boîte.
2.5. Expression des résultats.
Multiplier par 1.000 le nombre de colonies comptées par boîte pour obtenir le nombre de germes par millilitre de l'échantillon.
Si le nombre de colonies par boîte est inférieur à 10, indiquer "moins de 10.000 germes par millilitre". Si le nombre de colonies par boîte est supérieur à 600, donner le résultat comme "nombre estimé de germes par millilitre".
2.6. Répétabilité des résultats.
La différence entre les résultats de deux déterminations indépendantes (2.4.5. à 2.5.) d'un même échantillon de lait, effectuées dans des conditions de répétabilité (même opérateur, mêmes matériel et réactifs et laps de temps très court), ne doit pas, dans 95 % des cas, excéder 34 % de la moyenne des deux résultats. Cette valeur correspond à un coefficient de variation de répétabilité de 12 %.
Si cette valeur est dépassée dans 95 % des cas, le mode opératoire doit être revu pour déterminer les sources d'erreur.
3. Classement.
Les échantillons de lait sont répartis en trois classes suivant leur teneur en germes :
Note 1 - Lait contenant plus de 500.000 germes par millilitre.
Note 2 - Lait contenant plus de 100.000 germes par millilitre et jusqu'à 500.000 germes par millilitre.
Note 3 - Lait concernant jusqu'à 100.000 germes par millilitre.
4. Méthode de classement mensuel des laits
Le tableau ci-après permet de répartir les laits en trois classes suivant les résultats obtenus au cours du mois.
Notes obtenues pour les classes suivantes et selon le nombre de contrôle mensuels :
(tableau et schéma non reproduits, voir au Journal officiel).