Article Annexe AUTONOME VIGUEUR, en vigueur depuis le (Arrêté du 1 juin 1986 RELATIF A LA METHODE OFFICIELLE D'ANALYSE RELATIVE AU DENOMBREMENT DES CELLULES SOMATIQUES DANS LE LAIT CRU)
Article Annexe AUTONOME VIGUEUR, en vigueur depuis le (Arrêté du 1 juin 1986 RELATIF A LA METHODE OFFICIELLE D'ANALYSE RELATIVE AU DENOMBREMENT DES CELLULES SOMATIQUES DANS LE LAIT CRU)
Avant-propos.
Le prélèvement de l'échantillon doit être réalisé sur un lait rendu homogène par un dispositif d'agitation convenable et la quantité de lait à prélever doit être au minimum de 10 ml.
Les échantillons prélevés doivent être maintenus à une température inférieure ou égale à 6 °C et examinés dans les six heures qui suivent le prélèvement.
Si l'examen des échantillons ne peut être effectué dans les six heures, ils doivent être conservés par addition d'acide orthoborique dont la concentration finale ne doit pas excéder 0,6 p. 100 (m/v).
Les échantillons ainsi conservés peuvent être stockés pendant vingt-quatre heures à 6 °C maximum.
1. Objet et domaine d'application.
La présente méthode décrit une technique pour le dénombrement des cellules somatiques dans le lait cru frais ou le lait conservé par addition d'acide orthoborique.
Cette méthode de référence peut être également utilisée pour l'étalonnage des procédés mécaniques et automatiques de dénombrement des cellules.
2. Définition.
On entend par cellules somatiques les cellules dont le noyau peut être coloré distinctement au bleu de méthylène dans les conditions décrites ci-après.
3. Principe.
Etalement de 0,01 ml de lait sur 1 centimètre carré à la surface d'une lame porte-objet.
Le film de lait obtenu est séché et coloré. Le comptage s'effectue à l'aide d'un microscope.
Le nombre de cellules somatiques dénombrées pour une surface déterminée est multiplié par un facteur de multiplication afin d'obtenir le nombre de cellules par millilitre de lait.
4. Réactif.
Les produits chimiques doivent être de qualité analytique.
L'eau doit être de l'eau distillée, déionisée ou de pureté équivalente.
Solution de coloration :
Bleu de méthylène : 0,6 g.
Ethanol (95 % vol.) : 54,0 ml.
Tétrachloro-éthane : 40,0 ml.
Acide acétique glacial : 6,0 ml.
Préparation :
Mélanger l'éthanol et le tétrachloro-éthane dans un flacon et chauffer dans un bain d'eau à 60 - 70 °C, puis ajouter le bleu de méthylène et mélanger soigneusement ; refroidir au réfrigérateur à 4 °C pendant douze à vingt-quatre heures puis ajouter l'acide acétique. Filtrer sur filtre d'une porosité de 10 à 12 microns maximum et conserver cette préparation dans un flacon étanche. Si nécessaire, filtrer à nouveau avant usage.
Nota - Le tétrachloro-éthane étant toxique, les manipulations doivent être réalisées sous une hotte aspirante.
Le tétrachloro-éthane peut être remplacé par une quantité égale de trichloro 1-1-1 éthane.
5. Appareillage.
Matériels courant de laboratoire et notamment :
5.1. Microscope permettant un grossissement x 500 à x 1000.
5.2. Micromètre objectif gradué au 1/100 de mm.
5.3. Microseringue permettant de répartir des quantités de 0,01 ml avec une variation maximale de 2 p. 100.
5.4. Lames porte-objet en verre comportant un rectangle gravé de 20 mm x 5 mm.
5.5. Plaque chauffante (30 - 50 °C).
5.6. Appareil de séchage (type sèche-cheveux).
6. Mode opératoire.
L'étalement et le dénombrement doivent s'effectuer en double.
6.1. Traitement des lames porte-objet :
Juste avant l'usage, nettoyer les lames à l'éthanol par exemple, essuyer à l'aide d'un papier ne relâchant pas de particules, flamber et laisser refroidir à l'abri des poussières.
6.2. Préparation de l'échantillon pour essai :
Réchauffer l'échantillon dans un bain d'eau à 40 °C, puis mélanger soigneusement. Refroidir à environ 20 °C.
6.3. Préparation des étalements :
A partir de l'échantillon du lait à analyser, prélever 0,01 ml à l'aide de la microseringue (5.3). Essuyer soigneusement la partie externe de la seringue qui est entrée en contact avec le lait. Déposer le volume prélevé au centre du rectangle de 20 mm x 5 mm de la lame (5.4), le répartir sur cette surface aussi régulièrement que possible en s'aidant d'une épingle flambée. Laisser sécher l'étalement en portant la lame sur la plaque (5.5) qui doit être parfaitement horizontale afin d'obtenir un film d'épaisseur régulière.
6.4. Coloration des étalements :
Immerger les lames dans la solution colorante (4.1) pendant dix minutes.
Egoutter l'excès de colorant en plaçant une arête de la lame sur un papier buvard.
Sécher soigneusement à l'aide de l'appareil de séchage (5.6). Plonger avec précaution les lames dans de l'eau afin d'éliminer le surplus de colorant. Egoutter et sécher une nouvelle fois.
Conserver les lames à l'abri de la poussière.
6.5. Etalonnage du microscope :
A partir du grossissement choisi, entre x 500 et x 1000, mesurer à l'aide du micromètre objectif (5.2) le diamètre d du champ microscopique.
6.6. Dénombrement des cellules somatiques :
Le dénombrement des cellules consiste à dénombrer uniquement les noyaux des cellules nettement colorés et dont au moins la moitié est visible dans le champ microscopique.
Compter au minimum 50 champs répartis sur toute la surface de l'étalement suivant le schéma ci-dessous en utilisant les échelles graduées du microscope pour conduire le déplacement de la préparation.
(cliché non reproduit, voir au Journal officiel).
Le nombre de cellules somatiques à dénombrer dans chaque échantillon ne doit pas être inférieur à 400 (voir 7.2). Dans le cas contraire, recommencer le comptage en procédant à un décalage de 0,5 mm de façon à ne pas recompter les mêmes champs.
Soit c le nombre de champs microscopiques examinés.
7. Expression des résultats.
7.1. Nombre de cellules somatiques par millilitre de lait :
Le nombre de cellules somatiques dénombrées, multiplié par le facteur de multiplication donne le nombre de cellules somatiques par millilitre de lait.
Lorsque 0,01 ml de lait est utilisé pour la préparation, le facteur de multiplication est :
(formule non reproduite, voir au Journal officiel).
où :
d est le diamètre en millimètres du champ microscopique 6.5.
c est le nombre de champs microscopiques examinés 6.6.
7.2. Détermination du nombre minimal de cellules à compter :
Etant donné que le dénombrement microscopique des cellules somatiques peut être également utilisé pour l'étalonnage des procédés mécaniques et automatiques de dénombrement des cellules, le coefficient de variation des dénombrements ne doit pas être plus élevé que celui obtenu avec les appareils électroniques.
Le coefficient de variation pour un échantillon de lait contenant de 400 000 à 600 000 cellules par millilitre ne doit pas excéder 5 p. 100.
Ainsi, pour obtenir cette précision, le nombre de cellules somatiques à dénombrer dans chaque échantillon ne doit pas être inférieur à 400.
Selon la loi de distribution de Poisson.
où :
M est la valeur moyenne.
V est la variance.
s est l'écart-type.
Le coefficient de variation est :
M (moyenne) représente le nombre de particules (cellules) qui ont été dénombrées.
8. Procès-verbal.
Le procès-verbal doit indiquer notamment :
- l'identification de l'échantillon, type, origine ;
- la date, l'heure et le mode de prélèvement ;
- l'utilisation éventuelle d'acide orthoborique ;
- la date, l'heure de l'examen de laboratoire ;
- le facteur de multiplication de l'examen microscopique ;
- le résultat en nombre de cellules somatiques par millilitre de lait ;
- ainsi que toutes remarques effectuées au cours de la manipulation.