Aspect de la solution. La solution est limpide (2.2.1) et n'est pas plus fortement colorée que la solution de degré 5 de la gamme des solutions témoins présentant la coloration la plus appropriée (2.2.2, procédé II).
Dissolvez une quantité d'héparine sodique correspondant à 50 000 UI dans de l'eau R et complétez à 10 ml avec le même solvant.
pH (2.2.3) : 5,5 à 8,0.
Dissolvez 0,1 g d'héparine sodique dans de l'eau exempte de dioxyde de carbone R et complétez à 10 ml avec le même solvant.
Impuretés nucléotidiques. Dissolvez 40 mg d'héparine sodique dans 10 ml d'eau R.
L'absorbance (2.2.25) mesurée à 260 nm n'est pas supérieure à 0,15.
Protéines : au maximum 0,5 % (substance desséchée).
Solution A. Mélangez 2 volumes d'une solution d'hydroxyde de sodium R à 10 g/l et 2 volumes d'une solution de carbonate de sodium R à 50 g/l et complétez à 5 volumes avec de l'eau R.
Solution B. Mélangez 2 volumes d'une solution de sulfate de cuivre R à 12,5 g/l et 2 volumes d'une solution de tartrate de sodium R à 29,8 g/l et complétez à 5 volumes avec de l'eau R.
Solution C. Mélangez 1 volume de solution B et 50 volumes de solution A.
Solution D. Préparez une dilution au 1/2-1/4 d'un réactif phosphomolybdotungstique dans de l'eau R. Des dilutions appropriées permettent d'obtenir des solutions à pH 10,25 ± 0,25 après addition des solutions C et D aux solutions témoins et à examiner.
Solution à examiner. Dissolvez la substance à examiner dans de l'eau R pour obtenir une concentration de 5 mg/ml.
Solutions témoins. Dissolvez de l'albumine bovine R dans de l'eau R pour obtenir une concentration de 100 mg/ml. Préparez différentes dilutions de cette solution dans de l'eau R selon les indications données dans le chapitre général 2.5.33, méthode 2.
Solution à blanc : eau R.
Procédure. A1 ml de chaque solution témoin, de la solution à examiner et de la solution à blanc, ajoutez 5 ml de solution C. Laissez reposer pendant 10 min. Ajoutez 0,5 ml de solution D, mélangez et laissez reposer à température ambiante pendant 30 min. Déterminez les absorbances (2.2.25) des solutions à 750 nm, en utilisant la solution préparée à partir de la solution à blanc comme liquide de compensation.
Calculs. Selon les indications données dans le chapitre général 2.5.33, méthode 2.
Substances apparentées. Chromatographie liquide (2.2.29). Les solutions témoins sont stables pendant 24 h à température ambiante.
Solution à examiner (a). Dissolvez environ 50 mg d'héparine sodique, exactement pesés, dans 5,0 ml d'eau pour chromatographie R. Mélangez à l'aide d'un mélangeur de type vortex jusqu'à dissolution complète.
Solution à examiner (b). Dissolvez environ 0,1 g d'héparine sodique, exactement pesé, dans 1,0 ml d'eau pour chromatographie R. Mélangez à l'aide d'un mélangeur de type vortex jusqu'à dissolution complète. Mélangez 500 µl de solution avec 250 µl d'acide chlorhydrique 1 M, puis ajoutez 50 µl d'une solution de nitrite de sodium R à 250 mg/ml. Mélangez doucement et laissez reposer à température ambiante pendant 40 min, puis ajoutez 200 µl d'hydroxyde de sodium 1 M pour arrêter la réaction.
Solution témoin (a). Dissolvez 250 mg d'héparine pour analyse physicochimique SCR dans de l'eau pour chromatographie R et complétez à 2,0 ml avec le même solvant. Mélangez à l'aide d'un mélangeur de type vortex jusqu'à dissolution complète.
Solution témoin (b). Ajoutez 1 200 µl de solution témoin (a) à 300 µl de sulfate de dermatan et chondroïtine persulfatée SCR. Homogénéisez à l'aide d'un mélangeur de type vortex.
Solution témoin (c). Ajoutez 100 µl de solution témoin (b) à 900 µl d'eau pour chromatographie R. Homogénéisez à l'aide d'un mélangeur de type vortex.
Solution témoin (d). Ajoutez 400 µl de solution témoin (a) à 100 µl d'eau pour chromatographie R et mélangez à l'aide d'un mélangeur de type vortex. Ajoutez 250 µl d'acide chlorhydrique 1 M, puis 50 µl d'une solution de nitrite de sodium R à 250 mg/ml. Mélangez doucement et laissez reposer à température ambiante pendant 40 min, puis ajoutez 200 µl d'hydroxyde de sodium 1 M pour arrêter la réaction.
Solution témoin (e). A 500 µl de solution témoin (b), ajoutez 250 µl d'acide chlorhydrique 1 M, puis 50 µl d'une solution de nitrite de sodium R à 250 mg/ml. Mélangez doucement et laissez reposer à température ambiante pendant 40 min, puis ajoutez 200 µl d'hydroxyde de sodium 1 M pour arrêter la réaction.
Précolonne :
― dimensions : l = 0,05 m, Ø = 2 mm ;
― phase stationnaire : résine échangeuse d'anions R (13 m).
Colonne :
― dimensions : l = 0,25 m, Ø = 2 mm ;
― phase stationnaire : résine échangeuse d'anions R (9 m) ;
― température : 40 °C.
Phase mobile :
― phase mobile A : dissolvez 0,40 g de phosphate monosodique R dans 1 l d'eau pour chromatographie R et ajustez à pH 3,0 avec de l'acide phosphorique dilué R ;
― phase mobile B : dissolvez 0,40 g de phosphate monosodique R dans 1 l d'eau pour chromatographie R ; ajoutez 140 g de perchlorate de sodium R, puis ajustez à pH 3,0 avec de l'acide phosphorique dilué R ; filtrez et dégazez ;


Débit : 0,22 ml/min.
Détection : spectrophotomètre à 202 nm.
Equilibrage : au moins 15 min.
Injection : 20 µl de solution à examiner (b) et des solutions témoins (d) et (e).
Rétention relative par rapport à l'héparine (temps de rétention = environ 26 min) : sulfate de dermatan et sulfate de chondroïtine = environ 0,9 ; chondroïtine persulfatée = environ 1,3.
Conformité du système :
― le chromatogramme obtenu avec la solution témoin (d) ne présente pas de pic au temps de rétention de l'héparine ;
― résolution : au minimum 3,0 entre les pics dus au sulfate de dermatan + sulfate de chondroïtine et à la chondroïtine persulfatée dans le chromatogramme obtenu avec la solution témoin (e).
Limites :
― somme du sulfate de dermatan et du sulfate de chondroïtine : au maximum la surface du pic correspondant dans le chromatogramme obtenu avec la solution témoin (e) (2,0 %) ;
― toute autre impureté : aucun autre pic que celui dû au sulfate de dermatan + sulfate de chondroïtine n'est détecté.
Azote (2.5.9) : 1,5 % à 2,5 % (substance desséchée), déterminé sur 0,100 g d'héparine sodique.
Sodium : 9,5 % à 12,5 % (substance desséchée).
Spectrométrie d'absorption atomique (2.2.23, procédé I).
Solution à examiner. Dissolvez 50 mg d'héparine sodique dans une solution de chlorure de césium R à 1,27 mg/ml dans de l'acide chlorhydrique 0,1 M et complétez à 100,0 ml avec le même solvant.
Solutions de référence. Préparez des solutions de référence (25 ppm, 50 ppm et 75 ppm) à partir de la solution à 200 ppm de sodium (Na) R, diluée avec une solution de chlorure de césium R à 1,27 mg/ml dans de l'acide chlorhydrique 0,1 M.
Source : lampe à cathode creuse au sodium.
Longueur d'onde : 330,3 nm.
Dispositif d'atomisation : flamme de composition appropriée (par exemple 11 l d'air pour 2 l d'acétylène par minute).
Métaux lourds (2.4.8) : au maximum 30 ppm.
1,0 g d'héparine sodique satisfait à l'essai F. Préparez la solution témoin avec 3,0 ml de solution à 10 ppm de plomb (Pb) R.
Perte à la dessiccation (2.2.32) : au maximum 8,0 %, déterminé à 60 °C sur du pentoxyde de diphosphore R sous une pression ne dépassant pas 670 Pa pendant 3 h sur 1,000 g d'héparine sodique.
Endotoxines bactériennes (2.6.14) : moins de 0,01 UI par unité internationale d'héparine, si l'héparine sodique est destinée à la fabrication de préparations parentérales sans autre procédé approprié d'élimination des endotoxines bactériennes.