La sensibilité sur rameaux est notée selon la méthode suivante :
- un rejet est retenu par cépée ;
- les acervules sont dénombrées sur le tiers central du rejet. La période de notation doit se situer en dehors de la saison de végétation.
La durée du test varie de deux à quatre ans. Elle est dépendante du niveau d'infection et des conditions climatiques. Il est indispensable d'obtenir au moins deux notations dans des conditions idéales, c'est-à-dire lorsque le développement du parasite a été précoce et suffisamment important pour révéler le comportement des clones utilisés en témoin.
Les méthodes d'analyse statistique conseillées sont :
- pour la sensibilité foliaire :
- un codage des proportions des différentes classes de notations (Joannes et Pinon, 1982) : pour chaque plant, est attribuée une note de sensibilité de type : z = a.p1 + b.p2 + c.p3 + d.p4 + e.p5. Les valeurs pi correspondent aux proportions de feuilles appartenant à la classe i du tableau ci-dessus. Les coefficients de pondération a à e sont déterminés par une analyse factorielle des correspondances (coordonnées des classes sur le premier axe de l'analyse) ;
- puis une ANOVA sur les notes individuelles et une comparaison des moyennes clonales ;
- pour la sensibilité sur rameaux : une ANOVA et une comparaison des moyennes clonales.

C. - Références bibliographiques

FAO-CIP, 1975. Protocole international pour l'étude de la sensibilité au Marssonina brunnea. Commission internationale du peuplier, groupe de travail des maladies, Belgrade, 8 p.
Joannes H., Pinon J., 1982. Comparaison de deux méthodes d'estimation de l'infection de jeunes peupliers par le Marssonina Brunea (Ell. et Ev.), P. Magn. Eur. J. For. Path. 12, 87-96.

A N N E X E I V
PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL POUR LE TEST
DE SENSIBILITÉ AUX ROUILLES À MELAMPSORA
A. - But et conception des essais

Les rouilles à Melampsora peuvent compromettre la culture de clones sensibles. Sur les peupliers classiquement cultivés (section Aigeiros, Tacamahaca et leurs hybrides), trois espèces existent en France : M. larici-populina, M. allii-populina et M. medusae. Jusqu'à présent la troisième espèce n'est pas apparue nuisible et sa répartition classique est restreinte à la région située au sud de la ligne Bordeaux-Toulouse. M. larici-populina est la plus dangereuse et M. allii-populina offre une situation intermédiaire.
Des infections mixtes, par deux ou trois espèces de Melampsora, sont fréquentes et gênent l'interprétation des notations. Il convient donc de conduire les tests de sensibilité en nature soit dans des sites où M. larici-populina ou M. allii-populina sont nettement majoritaires, soit de provoquer une infection par l'espèce souhaitée.
L'expérience antérieure a montré que la fiabilité des tests de sensibilité des clones envers les rouilles sur le terrain était étroitement liée à la précocité, la quantité et la qualité de l'inoculum. Une infection tardive et/ou une faible pression d'inoculum ne permettent pas de mettre en évidence les clones trop sensibles qui ne devront pas être cultivés. L'aspect qualitatif de l'inoculum correspond à la composition de la population de l'agent pathogène en termes d'espèce de Melampsora et au sein de chaque espèce de la présence et des fréquences des virulences (combinées au sein des races) connues du parasite. L'absence ou la très faible fréquence d'une virulence se traduit par un apparent bon état sanitaire des clones dont l'infection exige la présence de cette virulence. On risque ainsi de juger intéressants des clones qui pourraient s'avérer très sensibles dès que la virulence en question sera bien représentée dans la population du parasite. Cette virulence deviendra d'autant plus fréquente que ces clones seront cultivés et de ce fait leur état sanitaire risque de se dégrader sérieusement.

B. - Protocole pour M. Larici-populina

La durée du test est de deux ans (ou le test comporte deux années de notation).
Mise en place du dispositif :
- effectif et disposition des boutures : 8 boutures par clone, 8 blocs de parcelles monoarbres ou 4 blocs (2 boutures, clone, bloc) ;
- espacement : de l'ordre 1 à 1,5 mètre entre les lignes et de 0,4 à 0,8 mètre sur les lignes, ces distances pouvant être adaptées en fonction du matériel utilisé pour l'entretien ;
- conduite des plants : recépage en fin de chaque année et conservation d'une pousse par souche ;
- clones témoins : Populus deltoides « 87B12 », « A4A », « Beaupré », « Brabantica », P. candicans « Aurora », « Hoogvorst », « Ogy », « Rap », « Raspalje », « Robusta » et « Unal ». Ces témoins seront plantés à raison de 24 boutures par clone. Des témoins devront être ajoutés en cas de découverte de nouvelle virulence ;
- plantation de jeunes mélèzes d'Europe : sur les lignes de bordures et sur une ligne centrale, cette dernière n'étant nécessaire que si un nombre assez élevé de clones est planté. Les boutures de peuplier doivent être distantes de moins de 5 mètres des mélèzes les plus proches. Prévoir un mélèze pour 10 à 12 boutures situées dans l'essai (non comprises les boutures des lignes de bordure et de la ligne centrale si elle existe). Les mélèzes sont plantés par couple pour limiter l'incidence d'un défaut éventuel de reprise de l'un d'entre eux ;
- bordures : plantées d'un clone compatible avec toutes les races connues « Fritzi-Pauley », « Raspalje », « Robusta », par exemple).
L'infection de l'essai est réalisée en apportant des feuilles de peuplier porteuses de télies de M. larici-populina (télies présentes sur la face supérieure des feuilles). Ces feuilles doivent être récoltées l'année précédant le test sur les clones : Populus deltoides « 87B12 », « A4A », « Beaupré », « Brabantica », Populus candicans « Aurora », « Hoogvorst », « Ogy », « Rap » et « Unal » (avec ajout de clone ad'hoc en cas de nouvelles virulences). La récolte doit concerner des feuilles prêtes à tomber. Ces feuilles seront stockées à l'extérieur dans des cages grillagées et séparément pour chaque clones. Durant la première quinzaine de mars de l'année suivante, ces feuilles seront rentrées dans un local pour y être séchées naturellement puis stockées (un lot par clone) de préférence en chambre froide, toujours dans des cages grillagées. Lorsque les mélèzes ont débourré (aiguilles en groupes prêts à s'étaler), des feuilles porteuses de télies sont placées au sol sous les mélèzes, face supérieure (celle portant les télies) orientées vers le ciel et sont aussitôt plaquées au sol au moyen d'un grillage. Il n'est pas judicieux de les arroser, mieux vaut attendre qu'une pluie humecte les feuilles et permette ainsi aux télies de libérer des spores pour contaminer les mélèzes.
Notation de l'infection :
Observations : il est conseillé d'observer l'infection des mélèzes puis celle des clones témoins et enfin des clones testés. La détection de la rouille sur mélèze (face inférieure des aiguilles) sera conduite entre la mi-avril et la mi-mai (ou plus tard en cas de retard dans l'implantation des mélèzes et/ou des feuilles porteuses de télies). Lorsque les premières infections sur mélèze auront été détectées (en noter la date), la détection de l'infection sur les clones témoins devrait intervenir 2 à 4 semaines plus tard (en noter la date).
Dates de notation : elles dépendront de la précocité et de l'intensité de l'infection, qui dépendent elles-mêmes de celles de la contamination des mélèzes et du climat (climat général et microclimat). L'objectif est de pouvoir conduire deux notations, l'une fin juillet-début août et la seconde fin août-début septembre. Selon le développement de l'épidémie, ces dates pourront être avancées ou retardées dans une fourchette de ± 2 semaines. La notation devra porter sur tous les plants en tests ainsi que sur tous les témoins. La notation des plants de bordure n'est pas strictement indispensable.
Méthode de notation : une note est attribuée visuellement à chaque plant lors de chaque notation, selon un barème de 1 à 9 :
1 = aucun sore sur tout le plant ;
2 = de 1 à 10 sores sur moins de 50 % des feuilles ;
3 = de 1 à 10 sores sur plus de 50 % des feuilles ;
4 = de 11 sores à 50 % de la surface couverte sur moins de la moitié des feuilles ;
5 = de 11 sores à 50 % de la surface couverte sur plus de la moitié des feuilles ;
6 = de 50 à 75 % de la surface couverte sur moins du quart des feuilles ;
7 = de 50 à 75 % de la surface couverte sur plus du quart des feuilles ;
8 = plus de 75 % de la surface couverte sur moins du quart des feuilles ;
9 = plus de 75 % de la surface couverte sur plus du quart des feuilles.
Lors de chaque notation d'infection, il sera aussi attribué à chaque plant une note décrivant succinctement son état de défeuillaison selon le barème :
1 = pas de défeuillaison ;
2 = défeuillaison faible à moyenne ;
3 = forte défeuillaison.
Dépouillement des données : après le calcul de la note moyenne de chaque clone (clones testés et clones témoins), un calcul statistique sera conduit de manière à définir cinq groupes homogènes. Ces groupes peuvent être définis comme suit :
1 : très sensible ;
2 : sensible ;
3 : peu sensible ;
4 : résistant ;
5 : très résistant.
Deux conditions doivent être remplies pour que le clone soit admis :
- les témoins doivent se répartir correctement dans les groupes (validité du test) ;
- le clone candidat n'appartient pas aux groupes 1 et 2.
Récolte de feuilles infectées : en fin de première année, et afin de disposer d'une source d'inoculum pour la seconde année, des feuilles porteuses de télies seront collectées selon la procédure décrite ci-dessus (§ Infection de l'essai).
Mesure de la hauteur des plants : après arrêt de la croissance, tous les plants devront être mesurés chaque année.

A N N E X E V
PROTOCOLE EXPÉRIMENTAL POUR LE TEST DE SENSIBILITÉ
AU CHANCRE BACTÉRIEN (XANTHOMONAS POPULI)

L'évaluation de la sensibilité au chancre bactérien à Xanthomonas populi se fait à l'unité expérimentale du centre de recherches INRA d'Angers. Le dispositif de type pépinière est établi avec 6 répétitions par clone. L'espacement est de 0,50 mètre sur la ligne et de 3 mètres entre chaque ligne (pour permettre l'entretien et le passage d'un tracteur).
Les tiges sont inoculées en septembre de la seconde année après plantation (une inoculation dès la première année n'est envisageable que pour un tri drastique).
Les clones sont testés pour leur sensibilité à deux races (1 et 4) de Xanthomonas populi. Ces deux races sont connues pour présenter une agressivité différentielle selon les clones. Deux souches sont utilisées comme références :
- pour la race 1 : une souche française (SPm) ;
- pour la race 4 : une souche anglaise (CFBP 2551).
Des clones témoins, dont la sensibilité est connue, sont utilisés comme références. Ces clones ont les caractéristiques suivantes :
- résistant : nigra Italica et Koster ;
- résistant race 1 et sensible race 4 : Fritzi Pauley et Boelare ;
- sensible race 1 et moyennement sensible race 4 : Blanc du Poitou et Dorskamp ;
- sensible race 1 et très sensible race 4 : S3-31 (P. trichocarpa de Grammont) ;
- sensible race 4 et très sensible race 1 : Donk et S6-2 (P. deltoides x P. trichocarpa de Grammont).

A. - Préparation de l'inoculum

Dans la mesure du possible, les souches utilisées sont entretenues sur le clone Blanc de Poitou par une inoculation en septembre et un réisolement en avril-mai de l'année suivante. D'autres souches conservées lyophilisées (collection CFBP) peuvent aussi être inoculées, elles sont alors réactivées à 20 °C en boîtes de Petri sur un milieu nutritif composé de 5 grammes d'extrait de levures, 5 grammes de peptone, 10 grammes de glucose et 15 grammes d'agar par litre d'eau distillée (LPGA).
Pour l'inoculation, les souches de Xanthomonas populi sont cultivées en tubes, sur pente du milieu nutritif gelosé (LPGA), pendant quarante-huit heures à 20 °C (étuve thermorégulée sans lumière). Une suspension bactérienne est préparée juste avant l'inoculation et ajustée à 108-109 cellules par millilitre avec de l'eau distillée stérile.

B. - Technique d'inoculation

Deux incisions transversales (environ 10 mm de large x 2 mm de haut) sont faites sur le tronc à environ 0,80 mètre et 1,20 mètre du sol. Les incisions sont faites en deux coups de greffoir (un premier puis un second à 2 mm au-dessus) de façon à atteindre le cambium et à évacuer la partie comprise entre les deux coupes. Sur la blessure fraîche sont aussitôt déposés 25 µl de la suspension bactérienne de Xanthomonas populi.

C. - Notation et résultat

Les chancres obtenus sont notés à la fin des troisième et quatrième années, soit un et deux ans après l'inoculation. Les deux chancres sont notés selon un indice de ceinturation (de 0 à 5) et la mesure de la longueur du chancre (en centimètres).
Echelle des correspondances entre l'indice de ceinturation et la sensibilité au chancre :
0 = aucun symptôme ;
1 = moins de 20 % de la circonférence du tronc est couverte par le chancre ;
2 = 20 à 40 % de la circonférence couverte par le chancre ;
3 = 40 à 60 % de la circonférence couverte par le chancre ;
4 = plus de 60 % de la circonférence est chancreuse mais pas la totalité ;
5 = ceinturation totale avec mort de la partie supérieure.
La moyenne des deux notations sur chaque arbre est utilisée pour l'analyse des résultats.
Pour évaluer la sensibilité de ces clones, il faut d'abord considérer l'indice de ceinturation à un an, puis son évolution au cours de la seconde année. La mesure de la longueur nous apporte une information sur l'expression des chancres. On peut admettre, selon l'expérience acquise, qu'au-dessous de l'indice 2 les clones testés présentent une bonne résistance, mais qu'au-dessus le risque d'un développement naturel du chancre bactérien devient important.
La notation à deux ans permet d'étudier la réaction du clone face au chancre avec trois cas possibles :
- tendance vers la cicatrisation ;
- stabilisation ;
- tendance vers la ceinturation.
Les clones suffisamment résistants présentent une tendance vers la cicatrisation au cours du temps.
Si un test drastique est pratiqué un an après la plantation, la réaction chancreuse est alors plus importante et conduit à remonter la limite des clones sensibles à l'indice 3. Seule l'évolution du chancre vers la cicatrisation permet de retenir des clones en limite de sensibilité.
Xanthomonas populi est une bactérie très particulière. L'isolement, la conservation et la préparation des souches à inoculer ne peuvent se faire que dans un laboratoire spécialisé en bactériologie avec du personnel connaissant bien cette bactérie. Par contre, il est tout à fait acceptable que les tests soient mis en oeuvre en dehors de la région d'Angers par quelqu'un respectant le protocole avec les souches prêtes à l'emploi, fournies par l'unité de pathologie végétale de l'INRA d'Angers. Il faudra alors se limiter à l'utilisation exclusive de la race 1 dans la partie Nord de la France où sévit la maladie et ainsi éviter l'introduction de la race 4.

A N N E X E V I
PROTOCOLE POUR LA SURVEILLANCE SANITAIRE
A. - Sources d'information

Les principaux insectes et maladies spécifiques aux peupliers sont décrits et illustrés dans les éléments bibliographiques suivants :
AFOCEL, 1997. Peuplier - Suivi phytosanitaire en pépinière - Part. 1 : Insectes ravageurs. Fiches Informations - Forêt de l'AFOCEL, n° 1 - 1997, fiche 542.
AFOCEL, 1997. Peuplier - Suivi phytosanitaire en pépinière - Part. 2 : Maladies du feuillage, des rameaux et des tiges. Fiches Informations - Forêt de l'AFOCEL, n° 2 - 1997, fiche 547.
Delplanque A. et al., 1998. Les Insectes associés aux peupliers. Editions Memor. Bruxelles, 460 p.
Si des échantillons doivent être prélevés et soumis à une expertise :
- dans le cas des feuilles, les envelopper individuellement dans du papier d'aluminium en inscrivant dessus au feutre tous les éléments relatifs à l'échantillon ;
- dans le cas des échantillons ligneux, préférer un conditionnement dans du papier et un carton. Prévoir un étiquetage sans ambiguïté permettant de lier l'échantillon aux documents papier d'accompagnement.

B. - Matériel préconisé

Jumelles et loupe.
Echenilloir ou scie pour prélèvement de rameaux ou de branches.

C. - Périodes d'observation

Feuillage et pousses de l'année : prévoir deux passages, un en juillet et un mi-septembre.
Organes ligneux : un passage hivernal, de préférence peu avant le débourrement, ainsi qu'en juillet, en même temps que les observations sur le feuillage (présence de sciure, trou de sorties des insectes).

D. - Recherche des symptômes - maladies

1. Symptômes foliaires (pépinières et plantations) :
Rechercher obligatoirement (et signaler) la présence de Marssonina brunnea, des rouilles à Melampsora et de la mosaïque virale. Pour les deux premières maladies, préciser si elles ont provoqué une défeuillaison. Dans le cas de M. brunnea, rechercher la présence de pustules sur les pousses de l'année ;
Autres maladies : signaler leur présence.
2. Symptômes sur organes ligneux aériens (plantations essentiellement) :
Rechercher obligatoirement la présence de chancres, tumeurs et nécroses et tout particulièrement de chancre bactérien (Xanthomonas populi), de nécrose à Discosporium populeum (anciennement Dothichiza populea) et, dans le cas de peupliers baumiers, trembles ou grisards, prévoir la recherche d'Hypoxylon mammatum.
La détection de nécroses d'écorce (et en particulier de D. populeum ou de Xanthomonas campestris est possible en pépinière).
Toutefois, la recherche de D. populeum devra obligatoirement avoir été conduite en plantation, la sensibilité à ce parasite s'exprimant en particulier après transplantation et/ou après des défeuillaisons par des parasites ou des insectes.

E. - Recherche des symptômes - insectes ravageurs

Rechercher préférentiellement la présence d'insectes xylophages. Signaler la présence d'orifices (avec ou sans écoulements de sciure). Lorsque le diagnostic est possible, signaler les espèces nuisibles suivantes : Charançon de la patience (Cryptorhynchus lapathi), Petite Sésie (Paranthrème tabaniformis), Sémasie (Gypsonoma aceriana), Petite Saperde (Compsidia populnea), Agrile (Agrilus suvorovi), Grande Saperde (Anaerea carcharias), Grande Sésie (Sesia apiformis).
Rechercher obligatoirement la présence du puceron lanigère (Phloeomyzus passerinii). Les symptômes, sécrétions cireuses blanchâtres, sont visibles sur les troncs de juin à septembre. Les premières colonisations sont discrètes, généralement localisées sur le tiers supérieur au niveau du houppier. Les attaques importantes sont observées dans des plantations d'au moins six-sept ans ; auparavant, les arbres sont généralement épargnés mais l'utilisation de manchons protecteurs à la base du tronc peut favoriser le développement du parasite sur des sujets jeunes.
Outre la présence du parasite, il est important d'évaluer son impact sur l'arbre en relevant les dégradations de l'écorce, les apparitions de nécroses sur le tronc, voire les mortalités. Il convient de rechercher les éventuels effets sur la croissance s'il est possible de les dissocier des autres facteurs biotiques ou abiotiques.