Article (Arrêté du 25 août 1997 portant additif no 38 à la Pharmacopée française (10e édition))
« Identification
« A. - Examinez le profil électrophorétique obtenu par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à une concentration supérieure ou égale à 12,5 % m/m (2.2.31). Comparez avec un venin de référence d'un insecte de la même espèce. « B. - Phospholipase A.
« La présence de la phospholipase A est mise en évidence en se rapportant à l'activité hydrolysante vis à vis de la lécithine de jaune d'oeuf incorporée dans un gel d'agarose. Le diamètre de la zone d'action de la phospholipase A est comparé à celui d'un témoin de phospholipase A 2 purifiée.
« Préparation des boîtes de Pétri. Ajoutez 1 g d'agarose pour diffusion R et 0,1 g d'azide de sodium R à 100 ml de solution tampon tris(hydroxyméthyl)aminométhane pH 7,95 R. Chauffez la solution sous agitation jusqu'à éclaircissement juste avant ébullition. Refroidissez la solution à 56 3 oC à l'aide d'un agitateur chauffant. Ajoutez 1 ml de solution de chlorure de calcium 0,01 M R et 1 ml de substrat de jaune d'oeuf R et mélangez. Versez cette solution en couche uniforme de 2 mm à 5 mm d'épaisseur dans des boîtes de Pétri. Faites solidifier. Conservez les boîtes retournées à une température de 2 oC à 8 oC.
« Solution à examiner. Préparez une solution de venin à examiner à la concentration de 200 mg/ml dans la solution d'albumine bovine R. Conservez dans la glace pendant l'utilisation.
« Solution témoin (a). Diluez au 1/25 la solution de phospholipase A2 de venin d'abeille R dans la solution d'albumine bovine R.
« Solution témoin (b). Diluez au 1/500 la solution de phospholipase A 2 de venin d'abeille R dans la solution d'albumine bovine R.
« Solution témoin (c). Diluez au 1/100 la solution témoin (a) dans la solution d'albumine bovine R.
« Percez dans chaque boîte de Pétri le nombre de puits approprié d'un diamètre de 4 mm environ. Aspirez les morceaux de gel d'agarose des puits ainsi que d'éventuelles traces de liquide. Laissez les boîtes à température ambiante pendant 3 heures environ. Aspirez le liquide résiduel éventuellement présent dans les puits avant de déposer les solutions. Déposez un même volume de solution de venin à examiner, de solution de phospholipase A 2 de venin d'abeille R, des solutions témoins (a), (b) ou (c) et de solution d'albumine bovine R. Effectuez en double les déterminations pour chaque solution.
Laissez incuber à 25 2 oC pendant 20 heures.
« Mesurez le diamètre des zones claires obtenues pour chaque dépôt à l'aide d'un dispositif de mesure approprié. Calculez la moyenne des valeurs obtenues pour la solution à examiner et chaque solution témoin.
- « pour les venins d'Apidae, le diamètre moyen d'hydrolyse est supérieur au diamètre moyen de la solution témoin (a) [20 U(1)/ml] ;
- « pour les venins de Vespidae, à l'exception de Dolichovespula sp., le diamètre moyen d'hydrolyse est supérieur au diamètre moyen de la solution témoin (b) [1 U(1)/ml] ;
- « pour les venins de Dolichovespula sp., le diamètre moyen d'hydrolyse est supérieur au diamètre moyen de la solution témoin (c) [0,2 U(1)/ml].
« Les venins de Vespidae donnent un cercle opaque à l'intérieur de la zone d'éclaircissement, ce qui permet de les distinguer du venin d'abeille.
« C. - Le venin d'hyménoptères pour produits allergènes satisfait à l'essai "Hyaluronidase".