A N N E X E I V

METHODE OFFICIELLE D'EVALUATION DU POTENTIEL IRRITANT PAR APPLICATION SUR LA MEMBRANE CHORIO-ALLANTOIDIENNE DE L'OEUF DE POULE

Objectif et principe

Cette méthode est une alternative à l'expérimentation animale pour l'évaluation du potentiel irritant des produits cosmétiques.
Le principe en est basé sur l'observation, par une personne entraînée, des effets irritants (hyperémie, hémorragie, coagulation) pouvant survenir dans les cinq minutes suivant le dépôt d'un produit sur la membrane chorio-allantoïdienne (MCA) d'oeuf de poule embryonné, au dixième jour d'incubation.
Dans le cas des produits cosmétiques, notamment à base de tensioactifs,
cette méthode est applicable à l'évaluation du potentiel irritant oculaire.

Matériel (liste indicative)

OEufs de poule embryonnés (la souche White Leghorn est recommandée), d'un poids compris entre 50 et 65 g le jour de la réception.
Enceinte thermostatée.
Incubateur à oeufs.
Lampe à mirer les oeufs.
Pince anatomique droite (pince à disséquer, brucelles, ...) à bouts mousse et sans mors.
Ciseaux à bouts ronds.
Bain thermostaté à 37 oC.
Chronomètre.
Pipettes, tubes à essai, béchers...
Seringues de 1 ml à 5 ml.
Balance de précision.
Soluté injectable de pentobarbital.
Eau pour préparations injectables.
Soluté isotonique de NaCl à 0,9 p. 100.

Protocole expérimental

Réception des oeufs

Dès réception, les oeufs fêlés ou cassés sont éliminés. Les autres sont conservés à l'abri de la lumière et à une température de 12 oC 1 oC (enceinte ou local adapté) pendant au moins vingt-quatre heures avant de les placer en couveuse.

Mise en couveuse

Les oeufs sont pesés et identifiés puis placés dans l'incubateur (température optimale : 37,8 oC, humidité comprise entre 50 et 60 p. 100). Si l'incubateur n'est pas équipé d'un système de retournement automatique, les oeufs doivent être retournés manuellement au moins deux fois par jour.
Pendant toute la durée de l'incubation, la température et l'humidité sont contrôlées et réglées si nécessaire.
Les oeufs sont placés en position verticale (poche d'air vers le haut) dès le début dans le cas d'incubateurs équipés de plateaux oscillants et au huitième jour d'incubation dans les autres cas.

Vérification des oeufs

Au dixième jour d'incubation, les oeufs sont mirés et les oeufs défectueux sont rejetés.

Essai proprement dit

Les différentes étapes de l'essai sont enchaînées rapidement sous un éclairage d'une intensité suffisante ne dégageant pas de chaleur afin de ne pas dessécher la MCA. Dans le cas contraire, l'atmosphère est humidifiée à l'aide, par exemple, d'un brumisateur.
L'oeuf étant placé verticalement sur un support (poche d'air vers le haut), la coquille est entaillée au niveau de la poche d'air en prenant soin de ne pas léser la MCA. A l'aide d'une pince ou d'une paire de ciseaux à bouts ronds, la coquille est enlevée jusqu'au niveau de la membrane coquillière.
Toute la surface de la membrane coquillière est alors humidifiée avec du soluté isotonique de chlorure de sodium tiédi à 37 oC. Le soluté est ensuite éliminé par inclinaison de l'oeuf. Avec une pince la membrane coquillière est décollée délicatement puis retirée afin de découvrir la membrane chorio-allantoïdienne sous-jacente.
Tout oeuf dont la membrane chorio-allantoïdienne est défectueuse ou présente des traces d'hémorragie est rejeté.
0,30 ml du produit à l'essai (pur ou dilué), maintenu à 37 oC, sont alors déposés délicatement sur la MCA à l'aide d'une seringue ou d'une pipette et le chronomètre est aussitôt déclenché. Après 20 secondes de contact, la membrane est rincée avec 5 ml de soluté isotonique de chlorure de sodium (maintenu à 37 oC) à l'aide d'une seringue en évitant toute projection brutale. Le liquide de rinçage est éliminé par inclinaison de l'oeuf. Les éventuels phénomènes d'irritation sont observés pendant 5 minutes selon la procédure décrite ci-après. Le temps exact d'apparition de chaque phénomène est relevé.
L'effet irritant du produit à l'essai (ou de chacune de ses dilutions) est évalué sur quatre oeufs. En fin d'essai, les oeufs reçoivent une injection de pentobarbital puis sont éliminés.

Procédure de lecture

Les observations prises en compte pour la notation du produit doivent être réalisées à l'oeil nu.
Les phénomènes observés (hyperémie, hémorragie, coagulation) ne sont pas retenus en fonction de leur intensité mais en fonction de leur présence : il s'agit d'une réponse de type tout ou rien.
Le temps est noté à l'apparition de chacun des phénomènes.

Hyperémie

Phénomène observé : des capillaires non visibles avant l'ajout du produit deviennent visibles, alors que les capillaires visibles se dilatent et deviennent plus rouges. Ce phénomène peut également affecter les vaisseaux de diamètre supérieur.

Hémorragie

Phénomène observé : libération de sang s'échappant des vaisseaux et/ou des capillaires, pouvant se présenter sous différents aspects, et notamment en << chou-fleur >>, en nappe, en voile diffus, en piqueté (le sang s'échappe ponctuellement à différents endroits de la membrane).
Il est à noter que :
- l'hémorragie peut présenter un caractère éphémère ; elle doit néanmoins être prise en compte ;
- l'observation, dans les 30 premières secondes, d'une hémorragie massive impose la prise en compte de l'hyperémie masquée.

Coagulation (opacité et/ou thrombose)

Opacité :

Phénomène observé : apparition sur tout ou partie de la membrane, soit d'un voile opalescent évoluant éventuellement vers une opacification, soit d'une opacification directe.
Il est nécessaire de vérifier que le phénomène n'est pas lié au comportement physicochimique du produit en milieu aqueux (par exemple formation d'un colloïde, d'un précipité, ...).
Thrombose :
Phénomène observé : rupture du flux sanguin dans les vaisseaux se traduisant par un aspect segmenté (alternance d'étranglements et de zones turgescentes plus ou moins sombres).
Il est à noter que les observations ne doivent pas prendre en compte les modifications intervenues au niveau des capillaires.

Résultats

Les phénomènes observés sont quantifiés selon le tableau ci-après, en fonction de leur délai d'apparition :

Notation en fonction du temps

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Vous pouvez consulter le tableau dans le JO no 0300 du 26/12/96 Page 19137 a 19139
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Le score pour chaque oeuf est la somme des notes d'hyperémie, d'hémorragie et de coagulation. La notation du produit testé est la moyenne arithmétique, arrondie à une décimale des scores obtenus sur quatre oeufs. La notation maximum est 21.
Le potentiel irritant sur la membrane chorio-allantoïdienne du produit à l'essai (pur ou dilué) est donné par l'échelle suivante :

Notation (N)

N 1.
1 N 5.
5 N 9.
N 9.

Classification

Pratiquement non irritant.
Faiblement irritant.
Modérément irritant.
Irritant.

Remarques importantes

Il est à noter que la reproductibilité des résultats est d'autant meilleure que la personne réalisant l'essai est entraînée et que les conditions expérimentales sont respectées.
De manière à vérifier la qualité des conditions opératoires et celle des expérimentateurs, il est conseillé de procéder régulièrement à des contrôles à l'aide d'une référence. A cet effet, l'établissement préalable d'une courbe étalon avec des solutions aqueuses à 0,05 p. 100 - 0,4 p. 100 et 3,2 p. 100 (m/v) de lauryl sulfobétaïne est recommandé.
L'expérimentateur appréciera le potentiel irritant du produit à l'essai par comparaison aux données acquises pour des produits de même catégorie.
Le rapport d'essai doit comporter toutes les indications prévues par les règles de bonne pratique de laboratoire.

Bibliographie

LUEPKE N.P. The Hen's egg test (HET) : << An alternative toxicity test >>.
Brit J. Dermatol. 1986, 115, Suppl. 31, 133-135.
LUEPKE N.P. ! KEMPER F.H. The HET-CAM test : << An alternative to the Draize eye test >>. Food Chem. Toxicol. 1986, 24, no 6/7, 495-496.

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